Isolatie van muizen coronaire vasculaire gladde spiercellen
Summary
Het doel van dit protocol is de isolatie en kweektechnieken van murine primaire vasculaire gladde spiercellen (VSMC's) van de coronaire circulatie demonstreren. Zodra VSMC's werden geïsoleerd, kunnen ze worden gebruikt voor vele standaard kweektechnieken.
Abstract
Terwijl de isolatie en kweek van vasculaire gladde spiercellen (VSMC's) van grote recipiënten inmiddels goed, zochten wij isoleren en kweken van VSMC's de coronaire circulatie. Harten met intacte aorta bogen werden verwijderd en geperfuseerd via retrograde Langendorff spijsvertering oplossing die 300 eenheden / ml collagenase type II, 0,1 mg / ml sojaboon-trypsineremmer en 1 M CaCl2. De perfusates werden verzameld bij 15 minuten intervallen gedurende 90 min, tot pellet gecentrifugeerd, geresuspendeerd in uitplaatmedia en geplaat op weefselkweekplaten. VSMC's werden gekenmerkt door de aanwezigheid van SM22α, α-SMA en vimentine. Een van de belangrijkste voordelen van deze techniek is de mogelijkheid om VSMC isoleren van de coronaire circulatie van muizen. Hoewel het kleine aantal cellen verkregen kunnen sommige van de toepassingen waarvoor de cellen kan worden gebruikt te beperken, kan geïsoleerd coronaire VSMC's worden gebruikt in een verscheidenheid aan goed gevestigde celkweektechnieken en ASSAys. Studies die VSMC's van genetisch gemodificeerde muizen kan verdere informatie over de structuur-functie en signalering processen die verband houden met vasculaire pathologieën te bieden.
Introduction
Het doel van deze methode is het vasculaire gladde spiercellen (VSMC's) van de muizen coronaire circulatie te isoleren voor gebruik in celkweek en standaard celkweek assays. We ontwikkelden deze techniek om de moleculaire mechanismen van vasculaire remodellering bij diabetes beoordelen. We hebben eerder gemeld naar binnen hypertrofische remodeling in het septum coronaire arteriolen in de db / db muismodel van diabetes 1. Vanwege de beperkte hoeveelheid weefsel in de muis septale kransslagaders standaard experimentele technieken onderzoeken eiwit veranderingen (bijvoorbeeld western blot) in db / db muizen en controlemuizen zijn best moeilijk. Bovendien hebben we eerder aangetoond dat de angiotensine receptor blokker (ARB) losartan vermindert de herinrichting waargenomen bij db / db muizen 2. Daarom, isolatie van de primaire VSMC's van de coronaire circulatie stelt ons in staat om verder te onderzoeken veranderingen in VSMC fenotype of geactiveerde signaalwegen in diabetische muizen, die contribu kan zijniten op nadelige coronaire arteriole remodeling.
Talrijke studies hebben canonieke signaalwegen met behulp van VSMC's geïsoleerd van knaagdieren aorta, toegelicht in plaats van in elke specifieke vasculaire bed. Wij hebben echter aangetoond vasculaire bed specifieke remodeling in coronaire aorta en mesenterische circulatie van db / db-muizen 1, suggereert de VSMC's in elk vaatbed kunnen verschillen. Daarom is het noodzakelijk om VSMC van elkaar vaatbed isoleren teneinde beter de pathologische veranderingen in elke set VSMC. Er zijn een groot aantal verschillende methoden voor het isoleren en kweken van aorta VSMCs. Echter, nu is er slechts één studie die op de isolatie van VSMC's van de muis coronaire circulatie 3 is gepubliceerd. Teng et al. als eerste een werkwijze voor het isoleren rapporteren van VSMC's de muis coronaire circulatie; Maar we hebben het protocol ingrijpend gewijzigd omdat ze ook geïsoleerde endotheliale cells. Andere labs hebben ook gebruik gemaakt van het protocol van Teng et al. Coronaire arteriële myocyten en luchtwegen spiercellen 4,5 gladde isoleren. De veranderingen die we hebben opgenomen zullen een populatie cellen sterk verrijkt voor VSMC's van de coronaire circulatie verkregen.
De retrograde perfusie van de geïsoleerde zoogdieren hart, of Langendorff techniek, werd opgericht in 1897 6 van Oscar Langendorff en wordt nog steeds veel gebruikt vandaag de dag voor de isolatie van cardiovasculaire cellen. De techniek die hier, in combinatie met de vooruitgang van de moderne murine genetische modificaties, een waardevol instrument voor nader onderzoek van de moleculaire gedrag van VSMC's van de coronaire circulatie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het doel van deze studie was om bestaande celisolatie protocollen aan te passen aan de opbrengst van coronaire gladde van muizen harten verhogen. Meeste pionierswerk in het gladde spierweefsel biologie werd uitgevoerd met gekweekte ratten aorta gladde spiercellen. Deze studies voorzien fundamentele kennis van de moleculaire mechanismen die VSMC groei, migratie en hypertrofie 7 te controleren. Aangezien het gebied vorderde, bleek dat VSMC fenotype en functie werd gecontroleerd door een aantal factoren vaatbed….
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (R01HL056046 naar PAL en K99HL116769 te AJT), en The Research Institute op Nationwide Children's Hospital (PAL en AJT).
Materials
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16140-071 | |
| HEPES 1M solution | Fisher | MT-25-060 | |
| Primocin – 20mL | Invivogen | ant-pm-2 | |
| DMEM (High Glucose, Sodium Pyruvate, L-Glutamine) | Life Technologies | 11995-065 | |
| MEM NEAA 10 mM 100X | Life Technologies | 11140-050 | |
| L-Glut 200 mM – Gibco | Life Technologies | 25030-081 | |
| Sterile Cell Strainer 100um nylon mesh | Fisher | 22363549 | |
| Nunclon Polystrene dish with lid, sterile, 35 mm | Fisher | 12-565-91 | |
| Harvard Apparatus black silk suture 5-0 | Fisher | 14-516-124 | |
| Collagenase Type-2 | Worthington Biochemical | LS004176 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 25mg | Sigma | T6522 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (clear) | Life Technologies | 14175-103 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (phenol red) | Life Technologies | 14170-161 | |
| 5.0 ml heating coil with degassing bubble trap | Radnoti | 158830 | |
| 11 plus pump | Harvard Apparatus | 70-2208 | |
| Circulating heated water pump | any brand will work |
References
- Katz, P. S., et al. Coronary arterioles in type 2 diabetic (db/db) mice undergo a distinct pattern of remodeling associated with decreased vessel stiffness. Basic Res Cardiol. 106 (6), 1123-1134 (2011).
- Husarek, K. E., et al. The angiotensin receptor blocker losartan reduces coronary arteriole remodeling in type 2 diabetic mice. Vascul Pharmacol. , (2015).
- Teng, B., Ansari, H. R., Oldenburg, P. J., Schnermann, J., Mustafa, S. J. Isolation and characterization of coronary endothelial and smooth muscle cells from A1 adenosine receptor-knockout mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290 (4), H1713-H1720 (2006).
- Oldenburg, P. J., Wyatt, T. A., Sisson, J. H. Ethanol attenuates contraction of primary cultured rat airway smooth muscle cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (5), 539-545 (2010).
- Xu, M., et al. Intracellular two-phase Ca2+ release and apoptosis controlled by TRP-ML1 channel activity in coronary arterial myocytes. Am J Physiol Cell Physiol. 304 (5), C458-C466 (2013).
- Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff—still viable in the new millennium. J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease. Physiol Rev. 84 (3), 767-801 (2004).
- Li, L., Miano, J. M., Cserjesi, P., Olson, E. N. SM22 alpha, a marker of adult smooth muscle, is expressed in multiple myogenic lineages during embryogenesis. Circ Res. 78 (2), 188-195 (1996).
- Santiago, J. J., et al. Cardiac fibroblast to myofibroblast differentiation in vivo and in vitro: expression of focal adhesion components in neonatal and adult rat ventricular myofibroblasts. Dev Dyn. 239 (6), 1573-1584 (2010).
- Fisher, S. A. Vascular smooth muscle phenotypic diversity and function. Physiol Genomics. 42A (3), 169-187 (2010).
- Archer, S. L. Diversity of phenotype and function of vascular smooth muscle cells. J Lab Clin Med. 127 (6), 524-529 (1996).
- Souza-Smith, F. M., et al. Mesenteric resistance arteries in type 2 diabetic db/db mice undergo outward remodeling. PLoS One. 6 (8), e23337 (2011).
- Thuroff, J. W., Hort, W., Lichti, H. Diameter of coronary arteries in 36 species of mammalian from mouse to giraffe. Basic Res Cardiol. 79 (2), 199-206 (1984).
