Isolering av Murine Coronary vaskulære glatte muskelceller
Summary
Hensikten med denne protokollen er å demonstrere de isolerings- og kulturteknikker av murine primære vaskulære glatte muskelceller (VSMCs) fra den koronare sirkulasjon. Når VSMCs har vært isolert, kan de brukes til mange vanlige kulturteknikker.
Abstract
Mens isolasjon og kultur av vaskulære glatte muskelceller (VSMCs) fra store fartøy er godt etablert, forsøkte vi å isolere og kultur VSMCs fra koronar sirkulasjon. Hjerter med intakte aorta buer ble fjernet og perfusert via retrograd Langendorff med fordøyelse løsning inneholdende 300 enheter / ml kollagenase type II, 0,1 mg / ml soyabønne-trypsininhibitor og 1 M CaCl2. De perfusates ble samlet opp ved 15 minutters intervaller i 90 minutter, pelletisert ved sentrifugering, resuspendert i pletteringsmateriale, og sådd ut på vevskulturskåler. VSMCs ble preget av tilstedeværelsen av SM22α, α-SMA, og vimentin. En av de viktigste fordelene ved å bruke denne teknikken er evnen til å isolere VSMCs fra den koronare sirkulasjon av mus. Selv om lite antall celler oppnådd kan begrense noen av de anvendelser for hvilke cellene kan anvendes, kan isolerte koronar VSMCs bli brukt i en rekke vel etablerte cellekulturteknikker og assays. Studier som undersøker VSMCs fra genmodifiserte mus kan gi nærmere opplysninger om struktur-funksjon og signalprosesser i forbindelse med vaskulære sykdommer.
Introduction
Målet med denne fremgangsmåte er å isolere vaskulære glatte muskelceller (VSMCs) fra den murine koronarsirkulasjonen for bruk i cellekultur og standard cellekulturanalyser. Vi har utviklet denne teknikk for å vurdere de molekylære mekanismer for vaskulær remodellering i diabetes. Vi har tidligere rapportert innover hypertrofisk ombygging i septal koronare arterioler i db / db mus modell av diabetes 1. På grunn av den begrensede mengden vev funnet i murine septal coronaries, standard eksperimentelle teknikker undersøke proteinforandringer (f.eks western blot) i db / db og kontroll mus er vanskelig i beste fall. I tillegg har vi tidligere har vist at den angiotensin reseptorblokker (ARB) losartan reduserer ombygging observert hos db / db-mus 2. Derfor isolering av primære VSMCs fra koronarsirkulasjonen tillater oss å undersøke ytterligere endringer i VSMC fenotype eller aktiverte signalveier i diabetiske mus, som kan være bidragetting for uheldige koronar arteriole ombygging.
Tallrike studier har belyst kanoniske signalveier ved hjelp av VSMCs isolert fra gnager aorta, istedet for i hver enkelt karseng. Vi har imidlertid vist vaskulær-seng spesifikk ombygging i koronar, aorta, og mesenteriets opplag av db / db mus 1, noe som tyder på VSMCs i hvert vaskulær seng kan være forskjellig. Derfor er det nødvendig å isolere VSMCs fra hver karseng for bedre å forstå de patologiske forandringer som forekommer i hvert sett av VSMCs. Det finnes en mengde ulike metoder for isolering og dyrking av aorta VSMCs. Men for tiden er det bare en studie som har blitt publisert på isolering av VSMCs fra mus koronar sirkulasjon tre. Teng et al. var den første til å rapportere en metode for å isolere VSMCs fra mus koronar sirkulasjon; Vi har imidlertid endret protokoll vesentlig som de også isolert endothelial cells. Andre laboratorier har også brukt protokollen fra Teng et al. Å isolere koronare arterielle muskelceller og luftveis glatte muskelceller 4,5. De endringer vi har innarbeidet vil gi en populasjon av celler som hadde høy konsentrasjon for VSMCs fra den koronare sirkulasjon.
Den retrograd perfusjon av isolerte pattedyr hjertet, eller Langendorff teknikk, ble etablert i 1897 seks av Oscar Langendorff og er fortsatt mye brukt i dag for isolering av hjerte-celler. Teknikken som presenteres her, kombinert med fremme av moderne murine genetiske modifikasjoner, gir et verdifullt verktøy for nærmere undersøkelse av den molekylære oppførselen VSMCs fra koronar sirkulasjon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hensikten med denne studien var å tilpasse eksisterende celleisolasjons protokoller for å øke utbyttet av koronar vaskulær glatt fra murine hjerter. Mesteparten av pionerarbeidet i vaskulær glatt muskulatur biologi ble utført med dyrkede rotte-aorta glatte muskelceller. Disse studiene gitt grunnleggende kunnskap om molekylære mekanismer som styrer VSMC vekst, migrasjon og hypertrofi 7. Imidlertid, ettersom feltet skred frem, ble det klart at VSMC fenotype og funksjon ble kontrollert av en rekke vaskul?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (R01HL056046 til PAL og K99HL116769 til AJT) og The Research Institute på Nationwide Children Hospital (til PAL og AJT).
Materials
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16140-071 | |
| HEPES 1M solution | Fisher | MT-25-060 | |
| Primocin – 20mL | Invivogen | ant-pm-2 | |
| DMEM (High Glucose, Sodium Pyruvate, L-Glutamine) | Life Technologies | 11995-065 | |
| MEM NEAA 10 mM 100X | Life Technologies | 11140-050 | |
| L-Glut 200 mM – Gibco | Life Technologies | 25030-081 | |
| Sterile Cell Strainer 100um nylon mesh | Fisher | 22363549 | |
| Nunclon Polystrene dish with lid, sterile, 35 mm | Fisher | 12-565-91 | |
| Harvard Apparatus black silk suture 5-0 | Fisher | 14-516-124 | |
| Collagenase Type-2 | Worthington Biochemical | LS004176 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 25mg | Sigma | T6522 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (clear) | Life Technologies | 14175-103 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (phenol red) | Life Technologies | 14170-161 | |
| 5.0 ml heating coil with degassing bubble trap | Radnoti | 158830 | |
| 11 plus pump | Harvard Apparatus | 70-2208 | |
| Circulating heated water pump | any brand will work |
References
- Katz, P. S., et al. Coronary arterioles in type 2 diabetic (db/db) mice undergo a distinct pattern of remodeling associated with decreased vessel stiffness. Basic Res Cardiol. 106 (6), 1123-1134 (2011).
- Husarek, K. E., et al. The angiotensin receptor blocker losartan reduces coronary arteriole remodeling in type 2 diabetic mice. Vascul Pharmacol. , (2015).
- Teng, B., Ansari, H. R., Oldenburg, P. J., Schnermann, J., Mustafa, S. J. Isolation and characterization of coronary endothelial and smooth muscle cells from A1 adenosine receptor-knockout mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290 (4), H1713-H1720 (2006).
- Oldenburg, P. J., Wyatt, T. A., Sisson, J. H. Ethanol attenuates contraction of primary cultured rat airway smooth muscle cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (5), 539-545 (2010).
- Xu, M., et al. Intracellular two-phase Ca2+ release and apoptosis controlled by TRP-ML1 channel activity in coronary arterial myocytes. Am J Physiol Cell Physiol. 304 (5), C458-C466 (2013).
- Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff—still viable in the new millennium. J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease. Physiol Rev. 84 (3), 767-801 (2004).
- Li, L., Miano, J. M., Cserjesi, P., Olson, E. N. SM22 alpha, a marker of adult smooth muscle, is expressed in multiple myogenic lineages during embryogenesis. Circ Res. 78 (2), 188-195 (1996).
- Santiago, J. J., et al. Cardiac fibroblast to myofibroblast differentiation in vivo and in vitro: expression of focal adhesion components in neonatal and adult rat ventricular myofibroblasts. Dev Dyn. 239 (6), 1573-1584 (2010).
- Fisher, S. A. Vascular smooth muscle phenotypic diversity and function. Physiol Genomics. 42A (3), 169-187 (2010).
- Archer, S. L. Diversity of phenotype and function of vascular smooth muscle cells. J Lab Clin Med. 127 (6), 524-529 (1996).
- Souza-Smith, F. M., et al. Mesenteric resistance arteries in type 2 diabetic db/db mice undergo outward remodeling. PLoS One. 6 (8), e23337 (2011).
- Thuroff, J. W., Hort, W., Lichti, H. Diameter of coronary arteries in 36 species of mammalian from mouse to giraffe. Basic Res Cardiol. 79 (2), 199-206 (1984).
