Isolamento de Murino vasculares coronários células musculares lisas
Summary
O objectivo deste protocolo é demonstrar as técnicas de isolamento e cultivo de células musculares murino primários liso vascular (VSMC) da circulação coronária. Uma vez que as VSMCs foram isolados, eles podem ser usados para várias técnicas de cultura convencionais.
Abstract
Embora o isolamento e cultura de células de músculo liso vascular (VSMCs) a partir dos navios de grande porte está bem estabelecida, procurou-se isolar e cultivar as VSMCs da circulação coronária. Corações com arcos aórticos intactos foram removidos e perfundidos através de Langendorff com solução de digestão retrógrada contendo 300 unidades / mL de colagenase tipo II, 0,1 mg / mL de inibidor de tripsina de soja e 1 M de CaCl2. Os perfusatos foram recolhidas a intervalos de 15 minutos durante 90 minutos, sedimentadas por centrifugação, ressuspensas em meio de plaqueamento, plaqueadas e em placas de cultura de tecidos. As VSMC foram caracterizados pela presença de SM22α, α-SMA, e vimentina. Uma das principais vantagens da utilização desta técnica é a capacidade de isolar VSMCs da circulação coronária de ratos. Embora o pequeno número de células obtidas podem limitar algumas das aplicações para as quais as células podem ser utilizados, VSMCs coronárias isoladas podem ser utilizadas em uma variedade de técnicas de cultura de células bem estabelecidos e assays. Estudos investigando VSMC de camundongos geneticamente modificados pode fornecer mais informações sobre a estrutura-função e os processos de sinalização associados com patologias vasculares.
Introduction
O objectivo deste método é isolar as células musculares lisas vasculares (VSMCs) a partir da circulação coronária murino para uso em cultura de células e ensaios de cultura de células padrão. Nós desenvolvemos esta técnica para avaliar os mecanismos moleculares da remodelação vascular na diabetes. Temos relatado anteriormente para dentro remodelação hipertrófica nas arteríolas coronárias septais no modelo de camundongo db / db de diabetes 1. Devido à quantidade limitada de tecido encontrado nas coronárias septais de murino, as técnicas experimentais padrão investigaram as alterações da proteína (por exemplo, transferência de Western) em ratinhos db / db e de controlo são difíceis na melhor das hipóteses. Além disso, temos mostrado previamente que o bloqueador do receptor de angiotensina (BRA) losartan reduz a remodelação observada em ratinhos db / db 2. Por conseguinte, o isolamento de VSMCs de primários a partir da circulação coronária nos permite investigar mudanças em CMLV fenótipo ou vias de sinalização activadas em ratos diabéticos, que podem ser contriting para adversa remodelação das arteríolas coronárias.
Numerosos estudos têm elucidado vias de sinalização que utilizam canónicos VSMCs isoladas a partir da aorta de roedores, em vez de em cada leito vascular específico. No entanto, nós demonstramos vascular-cama remodelação específica em coronárias, aorta, e circulações mesentéricas de ratinhos db / db 1, sugerindo que os VSMCs em cada leito vascular pode ser diferente. Por conseguinte, é necessário isolar a partir de VSMCs de cada leito vascular, a fim de melhor compreender as alterações patológicas que ocorrem em cada conjunto de VSMC. Há uma infinidade de diferentes métodos para o isolamento e cultura de VSMCs de aorta. No entanto, actualmente, há apenas um estudo que foi publicada no isolamento de VSMCs de rato a circulação coronária 3. Teng et ai. foi o primeiro a relatar um método para o isolamento de VSMCs de rato a circulação coronária; no entanto, temos alterado o protocolo significativamente como eles também isolado cel endotelialls. Outros laboratórios também têm utilizado o protocolo de Teng et al. Isolar miócitos arteriais coronárias e das vias aéreas células musculares lisas 4,5. As alterações que tenham incorporado irá produzir uma população de células altamente enriquecidas em VSMC da circulação coronária.
A perfusão retrógrada do coração dos mamíferos isolado, ou técnica de Langendorff, foi criada em 1897, 6 por Oscar Langendorff e ainda hoje é amplamente utilizado para o isolamento de células cardiovasculares. A técnica aqui apresentada, juntamente com o avanço das modificações genéticas modernas de murino, proporciona uma valiosa ferramenta para investigação mais detalhada do comportamento molecular de VSMC da circulação coronária.
Protocol
Representative Results
Discussion
O objetivo deste estudo foi adaptar protocolos de isolamento de células existentes para aumentar o rendimento de vascular coronariana suave de corações de ratinho. A maior parte do trabalho pioneiro na biologia do músculo liso vascular foi realizada com células de músculo liso de aorta de rato cultivadas. Estes estudos deram conhecimento fundamental dos mecanismos moleculares que controlam o crescimento VSMC, migração e hipertrofia 7. No entanto, como o campo progrediu, tornou-se evidente que VSMC fen…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (R01HL056046 para PAL e K99HL116769 para AJT) e do Instituto de Pesquisa do Hospital Infantil Nationwide (para PAL e AJT).
Materials
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16140-071 | |
| HEPES 1M solution | Fisher | MT-25-060 | |
| Primocin – 20mL | Invivogen | ant-pm-2 | |
| DMEM (High Glucose, Sodium Pyruvate, L-Glutamine) | Life Technologies | 11995-065 | |
| MEM NEAA 10 mM 100X | Life Technologies | 11140-050 | |
| L-Glut 200 mM – Gibco | Life Technologies | 25030-081 | |
| Sterile Cell Strainer 100um nylon mesh | Fisher | 22363549 | |
| Nunclon Polystrene dish with lid, sterile, 35 mm | Fisher | 12-565-91 | |
| Harvard Apparatus black silk suture 5-0 | Fisher | 14-516-124 | |
| Collagenase Type-2 | Worthington Biochemical | LS004176 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 25mg | Sigma | T6522 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (clear) | Life Technologies | 14175-103 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (phenol red) | Life Technologies | 14170-161 | |
| 5.0 ml heating coil with degassing bubble trap | Radnoti | 158830 | |
| 11 plus pump | Harvard Apparatus | 70-2208 | |
| Circulating heated water pump | any brand will work |
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