Isolering av murin Coronary vaskulära glatta muskelceller
Summary
Syftet med detta protokoll är att demonstrera isolerings- och odlingstekniker i murina primära vaskulära glatta muskelceller (VSMC) från kranskärlscirkulation. När VSMC har isolerats, kan de användas för många vanliga odlingstekniker.
Abstract
Medan isolering och odling av vaskulära glatta muskelceller (VSMC) från stora fartyg är väl etablerad, försökte vi isolera och kultur VSMC från kranskärlscirkulation. Hjärtan med intakta aorta valv avlägsnades och perfunderades via retrograd Langendorff med matsmältningen lösning innehållande 300 enheter / ml kollagenas typ II, 0,1 mg / ml sojaböntrypsininhibitor och 1 M CaCl2. De perfusat uppsamlades vid 15 minuters intervall under 90 min, pelleterades genom centrifugering, återsuspenderades i plating media, och ströks ut på vävnadsodlingsskålar. VSMC kännetecknades av närvaron av SM22α, α-SMA, och vimentin. En av de viktigaste fördelarna med att använda denna teknik är möjligheten att isolera VSMC från krans cirkulationen hos möss. Även ett litet antal celler erhållna kan begränsa några av de tillämpningar för vilka cellerna kan utnyttjas, kan isolerade koronar VSMC användas i en mängd olika väletablerade cellodlingstekniker och assays. Studier som undersöker VSMC från genetiskt modifierade möss kan ge ytterligare information om struktur och funktion och signal processer i samband med vaskulära patologier.
Introduction
Målet med denna metod är att isolera vaskulära glatta muskelceller (VSMC) från den murina kranskärlscirkulation för användning i cellkultur och standardcellodlingsanalyser. Vi utvecklat denna teknik för att bedöma de molekylära mekanismer för vaskulär remodellering vid diabetes. Vi har tidigare rapporterat inåt hypertrofisk remodellering i septala arteriolerna i db / db-musmodellen av diabetes 1. På grund av den begränsade mängden vävnad som finns i de murina septala kranskärlen, standard experimentella tekniker undersöker proteinförändringar (t.ex. western blot) i db / db och kontrollmöss är svårt i bästa fall. Dessutom har vi tidigare visat att angiotensin-receptorblockerare (ARB) losartan minskar remodeling observeras i db / db-möss 2. Därför isolering av primära VSMC från krans cirkulationen ger oss möjlighet att ytterligare undersöka förändringar i VSMC fenotyp eller aktiverade signalvägar i diabetiska möss, som kan vara contributing till negativa hjärt arteriole ombyggnad.
Ett flertal studier har klar kanoniska signalvägar med användning av VSMC isolerade från gnagare aorta, snarare än i varje specifik kärlbädd. Emellertid har vi visat vaskulär bädd specifik remodellering i krans, aorta, och mesenteriska cirkulationerna db / db-möss 1, vilket tyder de VSMC i varje kärlbädd kan vara olika. Därför är det nödvändigt att isolera VSMC från varje kärlbädden för att bättre förstå de patologiska förändringar som sker i varje uppsättning av VSMC. Det finns en uppsjö av olika metoder för att isolera och odla aorta VSMC. Men för närvarande finns det bara en studie som har publicerats på isoleringen av VSMC från mus kranskärlscirkulation 3. Teng et al. var först med att rapportera en metod för att isolera VSMC från mus kranskärlscirkulation; Men, har vi ändrat protokoll avsevärt eftersom de isolerade också endothelial cells. Andra laboratorier har också använt protokoll från Teng et al. Att isolera kransartärmuskelceller och luftvägarnas glatta muskelceller 4,5. Förändringarna vi har införlivat kommer att ge en population av celler höganrikat för VSMC från kranskärlscirkulation.
Den retrograd perfusion av den isolerade däggdjurs hjärta, eller Langendorff teknik, grundades 1897 6 av Oscar Langendorff och fortfarande används i stor utsträckning idag för isolering av hjärt-celler. Tekniken som presenteras här, tillsammans med utvecklingen av moderna murina genetiska modifieringar, ger ett värdefullt verktyg för närmare undersökning av den molekylära beteende VSMC från kranskärlscirkulation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Syftet med denna studie var att anpassa befintliga cellisoleringsprotokoll för att öka utbytet av koronar vaskulär glatt från murina hjärtan. Mest av pionjärarbete i vaskulär glatt muskulatur biologi utfördes med odlade råttaortaglattmuskelceller. Dessa studier förutsatt grundläggande kunskap om molekylära mekanismer som styr VSMC tillväxt, migration och hypertrofi 7. Eftersom området fortskred, blev det uppenbart att VSMC fenotyp och funktion kontrollerades av ett antal kärlbädd specifika fak…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (R01HL056046 till PAL och K99HL116769 till AJT), och The Research Institute vid Nationwide barnsjukhus (PAL och AJT).
Materials
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16140-071 | |
| HEPES 1M solution | Fisher | MT-25-060 | |
| Primocin – 20mL | Invivogen | ant-pm-2 | |
| DMEM (High Glucose, Sodium Pyruvate, L-Glutamine) | Life Technologies | 11995-065 | |
| MEM NEAA 10 mM 100X | Life Technologies | 11140-050 | |
| L-Glut 200 mM – Gibco | Life Technologies | 25030-081 | |
| Sterile Cell Strainer 100um nylon mesh | Fisher | 22363549 | |
| Nunclon Polystrene dish with lid, sterile, 35 mm | Fisher | 12-565-91 | |
| Harvard Apparatus black silk suture 5-0 | Fisher | 14-516-124 | |
| Collagenase Type-2 | Worthington Biochemical | LS004176 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 25mg | Sigma | T6522 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (clear) | Life Technologies | 14175-103 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (phenol red) | Life Technologies | 14170-161 | |
| 5.0 ml heating coil with degassing bubble trap | Radnoti | 158830 | |
| 11 plus pump | Harvard Apparatus | 70-2208 | |
| Circulating heated water pump | any brand will work |
References
- Katz, P. S., et al. Coronary arterioles in type 2 diabetic (db/db) mice undergo a distinct pattern of remodeling associated with decreased vessel stiffness. Basic Res Cardiol. 106 (6), 1123-1134 (2011).
- Husarek, K. E., et al. The angiotensin receptor blocker losartan reduces coronary arteriole remodeling in type 2 diabetic mice. Vascul Pharmacol. , (2015).
- Teng, B., Ansari, H. R., Oldenburg, P. J., Schnermann, J., Mustafa, S. J. Isolation and characterization of coronary endothelial and smooth muscle cells from A1 adenosine receptor-knockout mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290 (4), H1713-H1720 (2006).
- Oldenburg, P. J., Wyatt, T. A., Sisson, J. H. Ethanol attenuates contraction of primary cultured rat airway smooth muscle cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (5), 539-545 (2010).
- Xu, M., et al. Intracellular two-phase Ca2+ release and apoptosis controlled by TRP-ML1 channel activity in coronary arterial myocytes. Am J Physiol Cell Physiol. 304 (5), C458-C466 (2013).
- Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff—still viable in the new millennium. J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease. Physiol Rev. 84 (3), 767-801 (2004).
- Li, L., Miano, J. M., Cserjesi, P., Olson, E. N. SM22 alpha, a marker of adult smooth muscle, is expressed in multiple myogenic lineages during embryogenesis. Circ Res. 78 (2), 188-195 (1996).
- Santiago, J. J., et al. Cardiac fibroblast to myofibroblast differentiation in vivo and in vitro: expression of focal adhesion components in neonatal and adult rat ventricular myofibroblasts. Dev Dyn. 239 (6), 1573-1584 (2010).
- Fisher, S. A. Vascular smooth muscle phenotypic diversity and function. Physiol Genomics. 42A (3), 169-187 (2010).
- Archer, S. L. Diversity of phenotype and function of vascular smooth muscle cells. J Lab Clin Med. 127 (6), 524-529 (1996).
- Souza-Smith, F. M., et al. Mesenteric resistance arteries in type 2 diabetic db/db mice undergo outward remodeling. PLoS One. 6 (8), e23337 (2011).
- Thuroff, J. W., Hort, W., Lichti, H. Diameter of coronary arteries in 36 species of mammalian from mouse to giraffe. Basic Res Cardiol. 79 (2), 199-206 (1984).
