L'isolamento di Murine coronarica vascolari cellule muscolari lisce
Summary
Lo scopo di questo protocollo è quello di dimostrare l'isolamento e coltura tecniche di cellule muscolari murine primarie lisce vascolari (VSMC) dalla circolazione coronarica. Una volta VSMC sono stati isolati, essi possono essere utilizzati per vari tecniche di coltura standard.
Abstract
Mentre l'isolamento e la coltura di cellule muscolari lisce vascolari (VSMC) da navi di grandi dimensioni è ben definito, abbiamo cercato di isolare e la cultura VSMC dalla circolazione coronarica. Cuori con archi aortici intatti sono stati rimossi e perfusi via Langendorff retrograda con una soluzione di digestione contenente 300 unità / ml di collagenasi di tipo II, 0,1 mg / inibitore della tripsina di soia ml e 1 M CaCl 2. Le perfusates sono stati raccolti a 15 min intervalli di 90 minuti, pellet per centrifugazione, risospese in terreni in piastra, e placcato su piatti di coltura di tessuti. VSMC sono stati caratterizzati da presenza di SM22α, α-SMA, e vimentina. Uno dei principali vantaggi di utilizzare questa tecnica è la capacità di isolare VSMC dalla circolazione coronarica di topi. Sebbene il piccolo numero di cellule ottenute possono limitare alcune delle applicazioni per le quali possono essere utilizzate le cellule, isolate VSMC coronarie può essere utilizzato in una varietà di tecniche di coltura cellulare consolidate e assays. Gli studi che indagano VSMC da topi geneticamente modificati in grado di fornire ulteriori informazioni sulla struttura-funzione e dei processi di segnalazione associati a patologie vascolari.
Introduction
L'obiettivo di questo metodo è quello di isolare le cellule muscolari lisce vascolari (VSMC) dalla circolazione coronarica murino per l'impiego in colture cellulari e saggi standard di coltura cellulare. Abbiamo sviluppato questa tecnica per valutare i meccanismi molecolari di rimodellamento vascolare nel diabete. Abbiamo precedentemente riportato verso l'interno rimodellamento ipertrofico nelle arteriole coronariche del setto nel modello di topo db / db di diabete 1. A causa della limitata quantità di tessuto che si trova nelle coronarie setto murini, tecniche sperimentali standard di indagare variazioni proteiche (es Western blot) in topi db / db e controllo sono meno difficile. Inoltre, abbiamo già dimostrato che l'antagonista del recettore dell'angiotensina (ARB) losartan riduce il rimodellamento osservato nei topi db / db 2. Pertanto, l'isolamento di VSMCs primarie dalla circolazione coronarica ci permette di indagare ulteriormente cambiamenti nel fenotipo VSMC o vie di segnalazione attivati in topi diabetici, che possono essere contribuTing a negativo rimodellamento arteriole coronariche.
Numerosi studi hanno chiarito vie di segnalazione canoniche utilizzando VSMC isolate da aorta di roditori, piuttosto che in ogni letto vascolare specifica. Tuttavia, abbiamo dimostrato vascolare letto rimodellamento specifico coronarica, aortica, e circolazioni mesenteriche di topi db / db 1, suggerendo le VSMC in ogni letto vascolare può essere diverso. Pertanto, è necessario isolare VSMC da ogni letto vascolare per comprendere meglio i cambiamenti patologici che si verificano in ciascun gruppo di VSMC. Ci sono una pletora di diversi metodi per isolare e coltura VSMCs aortica. Tuttavia, attualmente, vi è un solo studio che è stato pubblicato l'isolamento di VSMC dal mouse circolazione coronarica 3. Teng et al. fu il primo a segnalare un metodo per isolare VSMCs dalla circolazione coronarica del mouse; tuttavia, abbiamo modificato in modo significativo il protocollo in quanto anche isolati cel endotelialeLS. Altri laboratori hanno anche utilizzato il protocollo da Teng et al. Isolare miociti arteriosi coronarici e delle vie aeree cellule muscolari lisce 4,5. Le alterazioni abbiamo incorporato produrrà una popolazione di cellule altamente arricchito per VSMCs dalla circolazione coronarica.
La perfusione retrograda del cuore dei mammiferi isolato, o la tecnica Langendorff, è stata fondata nel 1897 da Oscar 6 Langendorff ed è ancora ampiamente usato oggi per l'isolamento delle cellule cardiovascolari. La tecnica qui presentata, insieme con l'avanzamento delle moderne modificazioni genetiche murine, fornisce uno strumento prezioso per studiare più da vicino il comportamento molecolare VSMCs dalla circolazione coronarica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lo scopo di questo studio è stato quello di adattare i protocolli di isolamento delle cellule esistenti per aumentare la resa della coronaria liscia vascolare dai cuori murini. La maggior parte del lavoro pionieristico nella biologia vascolare muscolatura liscia è stata eseguita con le cellule muscolari lisce in coltura ratto aortica. Questi studi hanno fornito conoscenze fondamentali dei meccanismi molecolari che controllano la crescita VSMC, la migrazione e l'ipertrofia 7. Tuttavia, come il campo prog…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (R01HL056046 PAL e K99HL116769 a AJT), e L'Istituto di ricerca all'ospedale dei bambini di Nationwide (PAL e AJT).
Materials
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16140-071 | |
| HEPES 1M solution | Fisher | MT-25-060 | |
| Primocin – 20mL | Invivogen | ant-pm-2 | |
| DMEM (High Glucose, Sodium Pyruvate, L-Glutamine) | Life Technologies | 11995-065 | |
| MEM NEAA 10 mM 100X | Life Technologies | 11140-050 | |
| L-Glut 200 mM – Gibco | Life Technologies | 25030-081 | |
| Sterile Cell Strainer 100um nylon mesh | Fisher | 22363549 | |
| Nunclon Polystrene dish with lid, sterile, 35 mm | Fisher | 12-565-91 | |
| Harvard Apparatus black silk suture 5-0 | Fisher | 14-516-124 | |
| Collagenase Type-2 | Worthington Biochemical | LS004176 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 25mg | Sigma | T6522 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (clear) | Life Technologies | 14175-103 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (phenol red) | Life Technologies | 14170-161 | |
| 5.0 ml heating coil with degassing bubble trap | Radnoti | 158830 | |
| 11 plus pump | Harvard Apparatus | 70-2208 | |
| Circulating heated water pump | any brand will work |
References
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