Summary

Isolamento di cellule di topo coronarica endoteliali

Published: July 03, 2016
doi:

Summary

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

Abstract

Le cellule endoteliali linea la parete interna dei vasi sanguigni e svolgono un ruolo importante nella regolazione del tono vascolare, la permeabilità vascolare, e la formazione di nuovi vasi. La disfunzione delle cellule endoteliali è implicato nello sviluppo e nella progressione di molte malattie cardiovascolari, tra cui cardiopatia ischemica. Per esaminare la funzione e caratterizzazione di cellule endoteliali coronariche, isolamento delle cellule è il primo passo e richiede elevata purezza e quantità di condurre esperimenti successivi. Questo protocollo descrive un metodo efficiente per isolare topo adulto coronarie cellule endoteliali. Il cuore del mouse è sezionato e tritata in piccoli pezzi. Dopo la digestione del cuore utilizzando dispasi e collagenasi II, le cellule vengono lavate e incubate con perline magnetiche che sono coniugate con anticorpi anti-CD31. Le perle con le cellule endoteliali vengono lavati diverse volte e sono pronti per l'uso in varie applicazioni, tra cui l'imaging molecolare e biologica experimenti. Isolamento efficiente produce circa 10 4 cellule per un cuore con oltre il 90% di purezza.

Introduction

modelli murini di varie malattie cardiovascolari e disturbi metabolici portano cambiamenti fisiologici e molecolari che sono simili a quelli riscontrati in pazienti. Inoltre, l'alterazione genetica dei topi è un potente strumento che ci permette di indagare il ruolo patogenetico di geni specifici nello sviluppo e nella progressione delle malattie. Al giorno d'oggi,-specifica delle cellule di tipo gene-knock-in o topi -out si generino facilmente in molti laboratori e la misurazione di mRNA e livelli di proteine ​​in specifici tipi di cellule è il primo passo per determinare se i topi sono stati veramente geneticamente modificati.

Endotelio è un sottile strato singolo di cellule endoteliali (ECS) che riveste la parete vascolare interno. Le cellule endoteliali giocano un ruolo critico nella regolazione della tensione vascolare, la permeabilità vascolare, e la formazione di nuovi vasi 1,2. La disfunzione endoteliale è un segno distintivo di molte condizioni patologiche e cambiamenti nella funzione endoteliale può portare a diverse automalattie cardiovasco- 3,4. È quindi significativo per studiare la funzione delle cellule endoteliali in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche.

Ci sono diversi modi per isolare EC 5-8 e il metodo di isolamento deve essere ottimizzato a seconda di quale verranno utilizzati i tessuti e le specie. Questo perché EC da tessuti differenti di un elevato livello di eterogeneità rispetto ai marcatori di superficie e proteica 9. isolamento di successo di cellule endoteliali spesso può essere difficile e richiede un certo grado di formazione e la pratica. Una volta ottenuto, il metodo di isolamento proposto in questo protocollo rivela stabile ed efficiente.

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di ottenere il mouse coronarica ECS (MCECs) di alta qualità e quantità. Anche se la quantità di cellule raccolte da un cuore è meno di cellule raccolte da altri tessuti mediante altre tecniche, questa tecnica fornisce ancora betqualità ter. La purezza delle cellule endoteliali nella popolazione risultante è superiore al 90%. Così, questa tecnica sarebbe l'ideale per le applicazioni che si basano su cellule endoteliali puramente isolate come l'imaging cellulare.

Protocol

La ricerca sui topi è stato approvato dal Comitato Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC) della University of Arizona ed è stata eseguita secondo il National Institute of Health (NIH) le linee guida. NOTA: Le sezioni 1, 2 e 3 devono essere effettuate il giorno prima l'esperimento come impostazione. 1. Soluzioni Preparazione buffer di CD31 (50 ml) Aggiungere 50 ml 1 × Tampone fosfato salino (PBS) ad un tubo 50 ml. Pesare 0,05 g albumina sierica bovina (BSA) e 0,037 g di acido e…

Representative Results

L'isolamento di successo delle cellule endoteliali coronariche da un cuore del mouse si ottiene in genere circa 10 4 cellule con oltre il 90% di purezza con una forma di ciottoli. Per una popolazione pura di cellule endoteliali, si deve usare cautela in tutto il protocollo al fine di garantire un ambiente sterile priva di qualsiasi contaminazione. La comparsa di cellule allungate o allargate cellule all'interno della popolazione indica contaminazione con altri tipi di …

Discussion

Le cellule endoteliali più utilizzati nella ricerca sono cellule umane endoteliali della vena ombelicale (HUVEC) a causa della loro praticità e facilità di coltura. Tuttavia, molte ricerche richiede la disponibilità di un modello fisiologico raggiunto con l'isolamento delle cellule endoteliali da altri organi specifici 10. Le cellule endoteliali formano una popolazione molto minore di cellule nel tessuto cardiaco; il loro isolamento e la coltura grado di dimostrare di essere molto difficile.

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Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione da parte del National Institutes of Health (HL115578 ad A. Makino).

Materials

BSA Sigma A3311-10G
EDTA Fisher BP120-500
HBSS Fisher SH3026801
Hepes Sigma-Aldrich H4034-500G
Sodium Bicarbonate  Sigma S5761
D-(+)-Glucose  Sigma G7021-1KG
Sheep anti-rat IgG beads  Life Technologies F-410L DynaBeads pan mouse IgG , Thermo Fisher Scientific, cat# 11035
Rat anti-mouse PECAM Antibody  BD Pharmigen 550274 BD Biosciences
IFCS  Fisher SH30072.04
M199 Fisher MT10060-CV
Dispase (Neutral Protease) Worthington Biochemical Corp./Fisher LS02109
Collagenase Type II  Worthington Biochemical Corp./Fisher LS004176
Glycerol  Fisher BP381-1
Igepal Sigma 13021-50ml I3021-50 ml
Phosphatase inhibitor cocktail Sigma P0044-1ml
Protease inhibitor cocktail Sigma P8340-1 ml
Heparin  Sigma H3149-100KU
FBS  Fisher/Mediatech MT35010CV
D-Valine Sigma V1255-5G
EGS BD 356006 Corning
Penicillin/Streptomycin Fisher/Mediatech MT-30-002-Cl MT-30-002-CI

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Citer Cet Article
Luo, S., Truong, A. H., Makino, A. Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (113), e53985, doi:10.3791/53985 (2016).

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