Isolement de cellules de souris coronaire endothéliales

Summary

Ce protocole est préparé pour partager notre méthode d’isolement des cellules endothéliales coronaires de souris à des fins d’imagerie ou pour mener des expériences de biologie moléculaire.

Abstract

cellules endothéliales tapissent la paroi interne des vaisseaux sanguins et jouent un rôle important dans la régulation du tonus vasculaire, la perméabilité vasculaire, et la nouvelle formation vasculaire. le dysfonctionnement des cellules endothéliales est impliquée dans le développement et la progression de nombreuses maladies cardiovasculaires, y compris une maladie cardiaque ischémique. Pour examiner la fonction et la caractérisation des cellules endothéliales coronaires, l'isolement des cellules est la première étape et elle nécessite une grande pureté et en quantité pour effectuer des expériences ultérieures. Ce protocole décrit une méthode efficace pour isoler les cellules endothéliales coronaires de souris adulte. Le cœur de la souris est disséquée et hachée en petits morceaux. Après la digestion du coeur en utilisant la dispase II et de la collagénase, les cellules sont lavées et incubées avec des billes magnétiques qui sont conjuguées avec un anticorps anti-CD31. Les billes avec les cellules endothéliales sont lavées plusieurs fois et sont prêts à utiliser dans diverses applications, y compris l'imagerie et de biologie moléculaire experiments. L' isolement efficace donne environ 10 ⁴ cellules par un seul cœur avec plus de 90% de pureté.

Introduction

Des modèles de souris de diverses maladies cardio-vasculaires et des troubles métaboliques portent des changements physiologiques et moléculaires qui sont similaires à celles observées chez les patients. En outre, la modification génétique de la souris est un outil puissant qui nous permet d'étudier le rôle pathogène de gènes spécifiques dans le développement et la progression des maladies. De nos jours, le gène knock-in type de cellule spécifique ou souris -out sont facilement générés dans de nombreux laboratoires et la mesure de l'ARNm et les niveaux de protéines dans des types cellulaires spécifiques est la première étape pour déterminer si les souris ont ....

Protocol

La recherche sur des souris a été approuvée par le Comité institutionnel des animaux soin et l'utilisation (IACUC) de l'Université de l'Arizona et a été réalisée selon l'Institut national de la santé (NIH) des lignes directrices.

NOTE: Les articles 1, 2 et 3 doivent être effectuées la veille de l'expérience que l'installation.

1. Solutions Préparation

1. un tampon de CD31 (50 ml)
   1. Ajouter 50 ml de 1 x tampon phosphate salin (PBS) à un tube de 50 ml. Peser 0,05 g de sérum-albumine bovine (BSA) et 0,037 g d'acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA) et les ajouter au tube de 50 ml et mettre le tube en rotatio....

Results

L'isolement réussie des cellules endothéliales coronaires d'un coeur de la souris donne généralement autour de 10 ⁴ cellules avec plus de 90% de pureté avec une forme de pavés. Pour une population pure de cellules endothéliales, des précautions doivent être prises tout au long du protocole afin d'assurer un environnement stérile exempt de toute contamination. L'apparition de cellules allongées ou des cellules agrandies dans la population indique une contamination avec d'autres.......

Discussion

Les cellules endothéliales les plus largement utilisés dans la recherche sont des cellules humaines de la veine ombilicale endothéliales (HUVEC) en raison de leur commodité et la facilité de culture. Cependant, beaucoup de recherches , il faut disposer d'un modèle physiologique atteint par l'isolement des cellules endothéliales provenant d' autres organes spécifiques ^10. Les cellules endotheliales forment une population mineure de cellules dans le tissu cardiaque; leur isolement et leur culture pe.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BSA	Sigma	A3311-10G
EDTA	Fisher	BP120-500
HBSS	Fisher	SH3026801
Hepes	Sigma-Aldrich	H4034-500G
Bicarbonate de sodium  ;	Sigma	S5761
D-(+)-Glucose  ;	Sigma	G7021-1KG
DynaBeads pan souris Perles IgG  ;	Thermo Fisher Scientific	11035
Anticorps anti-souris CD31 pour rat	BD Biosciences	550274
IFCS  ;	Fisher	SH30072.04
M199	Fisher	MT10060-CV
Dispase (protéase neutre)	Worthington Biochemical Corp./Fisher	LS02109
Collagénase de type II  ;	Worthington Biochemical Corp./Fisher	LS004176
Glycérol  ;	Fisher	BP381-1
Igepal	Sigma	I3021-50 ml
Cocktail inhibiteur de la phosphatase	Sigma	P0044-1ml
Cocktail inhibiteur de protéase	Sigma	P8340-1 ml
Héparine  ;	Sigma	H3149-100KU
FBS  ;	Fisher/Mediatech	MT35010CV
D-Valine	Sigma	V1255-5G
EGS	Corning	356006
Pénicilline/Streptomycine	Fisher/Mediatech	MT-30-002-CI