Summary

Isolering av mus koronära endotelceller

Published: July 03, 2016
doi:

Summary

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

Abstract

Endotelceller linje den inre väggen av blodkärlen och spelar en viktig roll vid regleringen av det vaskulära tillståndet, vaskulär permeabilitet, och ny kärlbildning. Endothelial celldysfunktion är inblandad i utvecklingen och utvecklingen av många kardiovaskulära sjukdomar, inklusive ischemisk hjärtsjukdom. Att undersöka funktionen och karakterisering av koronara endotelceller, är cellisolering det första steget och det kräver hög renhet och mängd för att utföra efterföljande experiment. Detta protokoll beskriver en effektiv metod för att isolera en vuxen mus koronära endotelceller. Musen hjärta är dissekeras och hackades till små bitar. Efter uppslutningen av hjärtat med användning av dispas och kollagenas II, tvättas cellerna och inkuberas med magnetiska kulor som är konjugerade med anti-CD31-antikropp. Pärlorna med endotelceller tvättas flera gånger och är redo för användning i olika tillämpningar, inklusive avbildning och molekylärbiologisk experiments. Effektiv isolering ger ungefär 10 4 celler per ett hjärta med över 90% renhet.

Introduction

Musmodeller av olika kardiovaskulära sjukdomar och ämnesomsättningssjukdomar bära fysiologiska och molekylära förändringar som är liknande de som finns hos patienter. Dessutom är genetisk förändring av möss ett kraftfullt verktyg som gör det möjligt för oss att undersöka den patogena roll specifika gener i utvecklingen och utvecklingen av sjukdomar. Numera celltyp-specifik gen-knock-in eller -out möss lätt bildas i många laboratorier och mätningen av mRNA och proteinnivåer i specifika celltyper är det första steget vid bestämning av huruvida mössen verkligen genetiskt modifierade.

Endotel är ett tunt enda skikt av endotelceller (ECS) som linjer inre kärlväggen. Endotelceller spelar en avgörande roll i regleringen av vaskulär spänning, vaskulär permeabilitet och ny kärlbildning 1,2. Endoteldysfunktion är ett kännetecken för många patologiska tillstånd och förändringar i endotelfunktion kan leda till olika bildiovascular sjukdomar 3,4. Det är sålunda betydelsefullt att studera funktionen av endotelceller under fysiologiska och patofysiologiska tillstånd.

Det finns flera sätt att isolera EC 08/05 och isoleringsmetoden måste optimeras beroende på vilken vävnader och arter kommer att användas. Detta beror på att EC från olika vävnader uppvisar en hög nivå av heterogenitet med avseende på deras ytmarkörer och proteinuttryck 9. Framgångsrik isolering av endotelceller kan ofta vara svårt och kräver en viss grad av utbildning och praktik. En gång uppnåtts, metoden av isolering som föreslås i detta protokoll visar sig vara stabil och effektiv.

Det övergripande målet med denna metod är att få mus krans EC (MCECs) av hög kvalitet och kvantitet. Även om den mängd av celler som samlats in från ett hjärta är mindre än celler som samlats in från andra vävnader med hjälp av andra tekniker, ger denna teknik fortfarande satsningter kvalitet. Renheten av endotelceller i den resulterande populationen är större än 90%. Således skulle denna teknik vara perfekt för applikationer som är beroende på rent isolerade endotelceller såsom cell imaging.

Protocol

Forskningen på möss godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid universitetet i Arizona och genomfördes i enlighet med National Institute of Health (NIH) riktlinjer. OBS: Avsnitt 1, 2 och 3 ska utföras dagen före experimentet som installationen. 1. framställning av lösningar CD31-buffert (50 ml) Tillsätt 50 ml 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till en 50 ml-rör. Väg 0,05 g bovinserumalbumin (BSA) och 0,037 g etylendiamintetraättiksyra (…

Representative Results

Den framgångsrika isoleringen av koronara endotelceller från en mus hjärta ger typiskt cirka 10 4 celler med över 90% renhet med en gatsten form. För en ren population av endotelceller, bör försiktighet iakttas i hela protokollet för att säkerställa en steril miljö fri från föroreningar. Uppkomsten av långsträckta celler eller förstorade celler inom populationen indikerar kontaminering med andra celltyper, glatta muskelceller och fibroblaster. Endotelcell renhe…

Discussion

De mest använda endotelceller i forskning är mänskliga navelvenendotelceller (HUVEC) på grund av deras bekvämlighet och odling. Men en hel del forskning kräver tillgång till en fysiologisk modell uppnås genom isolering av endotelceller från andra specifika organ 10. Endotelceller utgör en mycket liten population av celler i hjärtvävnaden; deras isolering och odling kan visa sig vara mycket svårt.

Det finns tre viktiga steg i detta protokoll. Den första är att spola …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av bidrag från National Institutes of Health (HL115578 till A. Makino).

Materials

BSA Sigma A3311-10G
EDTA Fisher BP120-500
HBSS Fisher SH3026801
Hepes Sigma-Aldrich H4034-500G
Sodium Bicarbonate  Sigma S5761
D-(+)-Glucose  Sigma G7021-1KG
Sheep anti-rat IgG beads  Life Technologies F-410L DynaBeads pan mouse IgG , Thermo Fisher Scientific, cat# 11035
Rat anti-mouse PECAM Antibody  BD Pharmigen 550274 BD Biosciences
IFCS  Fisher SH30072.04
M199 Fisher MT10060-CV
Dispase (Neutral Protease) Worthington Biochemical Corp./Fisher LS02109
Collagenase Type II  Worthington Biochemical Corp./Fisher LS004176
Glycerol  Fisher BP381-1
Igepal Sigma 13021-50ml I3021-50 ml
Phosphatase inhibitor cocktail Sigma P0044-1ml
Protease inhibitor cocktail Sigma P8340-1 ml
Heparin  Sigma H3149-100KU
FBS  Fisher/Mediatech MT35010CV
D-Valine Sigma V1255-5G
EGS BD 356006 Corning
Penicillin/Streptomycin Fisher/Mediatech MT-30-002-Cl MT-30-002-CI

References

  1. Michiels, C. Endothelial cell functions. J Cell Physiol. 196, 430-443 (2003).
  2. Sumpio, B. E., Riley, J. T., Dardik, A. Cells in focus: endothelial cell. Int J Biochem Cell Biol. 34, 1508-1512 (2002).
  3. Cines, D. B., et al. Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders. Blood. 91, 3527-3561 (1998).
  4. Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance. Circulation. 115, 1285-1295 (2007).
  5. Jin, Y., Liu, Y., Antonyak, M., Peng, X. Isolation and characterization of vascular endothelial cells from murine heart and lung. Methods Mol Biol. 843, 147-154 (2012).
  6. Makino, A., Platoshyn, O., Suarez, J., Yuan, J. X., Dillmann, W. H. Downregulation of connexin40 is associated with coronary endothelial cell dysfunction in streptozotocin-induced diabetic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 295, C221-C230 (2008).
  7. Marelli-Berg, F. M., Peek, E., Lidington, E. A., Stauss, H. J., Lechler, R. I. Isolation of endothelial cells from murine tissue. J Immunol Methods. 244, 205-215 (2000).
  8. van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat Protoc. 3, 1085-1091 (2008).
  9. Nolan, D. J., et al. Molecular signatures of tissue-specific microvascular endothelial cell heterogeneity in organ maintenance and regeneration. Dev Cell. 26, 204-219 (2013).
  10. Sobczak, M., Dargatz, J., Chrzanowska-Wodnicka, M. Isolation and culture of pulmonary endothelial cells from neonatal mice. J Vis Exp. , (2010).
  11. Makino, A., Dai, A., Han, Y., Youssef, K. D., Wang, W., Donthamsetty, R., Scott, B. T., Wang, H., Dillmann, W. H. O-GlcNAcase overexpression reverses coronary endothelial cell dysfunction in type 1 diabetic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 309, C593-C599 (2015).
  12. Sasaki, K., Donthamsetty, R., Heldak, M., Cho, Y., Scott, B. T., Makino, A. VDAC: old protein with new roles in diabetes. Am J Physiol Cell Physiol. 303, C1055-C1060 (2012).
check_url/fr/53985?article_type=t

Play Video

Citer Cet Article
Luo, S., Truong, A. H., Makino, A. Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (113), e53985, doi:10.3791/53985 (2016).

View Video