The objective of the study was to assess the biological impact of 15 cigarette smoke constituents using a combination of an impedance-based real time cell analyzer and a high-content screening (HCS)-based platform for toxicological assessment in vitro. This study provides information on effective doses, toxicity and modes of action of the tested compounds.
Cigarettrök (CS) är en viktig riskfaktor för hjärt- och lungsjukdomar. Eftersom CS är en komplex aerosol som innehåller mer än 7000 kemikalier ett det är svårt att bedöma bidragen från enskilda beståndsdelar till dess totala toxicitet. Toxikologiska profiler av enskilda beståndsdelar liksom blandningar kan dock etableras in vitro, genom att tillämpa höga genomlopps screening verktyg, som gör det möjligt att profilering av skadliga och potentiellt skadliga beståndsdelar (HPHCs) av tobaksrök, enligt definitionen i US Food and Drug administration (FDA). 2
För en första bedömning, var en impedans baserat instrument som används för en realtids, etikett-fri bedömning av föreningens toxicitet. Instrumentet avläsning bygger på celladhesion, livskraft och morfologi som tillsammans ger en översikt över cellens status. En dimensions parameter som heter cell index används för kvantifiering. En uppsättning av difka färgningsprotokoll har utvecklats för ett fluorescens avbildning baserad undersökning och en HCS plattform användes för att få mer detaljerad information om vilken typ av cytotoxicitet framkallad av varje HPHC.
Av de 15 beståndsdelar testade bara fem valdes ut för HCS baserad analys som de registrerade en beräkningsbar LD 50 (<20 mm). Dessa inkluderade en-aminonaphtalene, arsenik (V), krom (VI), Krotonaldehyd och fenol. Baserat på deras effekt i HCS, kan en-aminonaphtalene och Fenol identifieras för att inducera mitokondriell dysfunktion, och tillsammans med krom (VI) som genotoxiskt vilket baseras på den ökade histon H2AX fosforylering. Krotonaldehyd identifierades som en oxidativ stress inducerare och arsenik som en stress-kinasvägen aktivator.
Denna studie visar att en kombination av impedans-baserade och HCS teknik tillhandahåller ett kraftfullt verktyg för in vitro-bedömning av CS beståndsdelar.
Toxikologiska riskbedömningen har historiskt förlitat sig på användningen av djurmodeller som, även om grundläggande i biovetenskap, är också kopplade med brister som inkonsekvent översättbarhet för människor och höga kostnader. Dessutom har det skett en ökad ansträngning för att hitta alternativ till djurförsök i en anda av "3R" 2 (ersättning, begränsning och förfining). Detta arbete har ökat under de senaste åren, inte bara på grund av de senaste framstegen såsom hög genomströmning tekniker och systembiologiska metoder, men också på grund av lagstiftning som begränsar användningen av djurförsök, särskilt i EU.
Komplexiteten i cellulära signaleringsvägar som reglerar svar på giftiga förolämpningar gör det uppenbart att användning av enskilda toxikologiska endpoints inte kommer att vara tillräcklig för att beskriva den toxikologiska grund av vissa föreningar. För detta samspelet mellan hundratals samverkande proteins som bidrar till en biologisk nätverk kommer också att behöva tas med i beräkningen. För att studera effekten av gifter på dessa nätverk, är ett system toxikologi strategi kombinerat med fenotypiska medelhög och hög genomströmning screeningsanalyser användbara för att sluta potenser och samtidigt ge mer information om verkningsmekanismen för enskilda gifter.
I denna studie använde vi HCS som ett kraftfullt screeningmetod, som består av ett automatiserat mikroskop och en biologisk program, som kan förvärva, bearbeta och analysera bilddata härrör från specifika fluorescensbaserade cellulära analyser. Detta medger visuella förändringar inom en cell som skall kvantifieras, vid en enda cell eller subcellulär nivå, och många parametrar som skall analyseras samtidigt. 3 Till exempel har DNA-dubbelsträngbrott utvärderades med användning av en antikropp-baserad identifiering av histon H2AX fosforylering och reaktiva syreradikaler (ROS) kvantifierades med hjälp av en cell-permeable superoxid känsligt färgämne.
Eftersom lungepitelceller representerar första biologisk barriär mot inhalerade gifter, inklusive cigarettrök, utnyttjade vi primära bronkiala epitelceller som ett in vitro-modell för att profilera effekten av HPHCs offentliggjorts av den amerikanska myndigheten Food and Drug Administration. 4 Detta manuskript är en uppföljning -upp på en tidigare studie 5 där vi utvärderat biologiska effekterna av en annan delmängd av HPHCs.
Som en del av vårt arbetsflöde för att bedöma cytotoxicitet in vitro, vi inledningsvis utvärderat potenser av ett urval av 15 HPHC s med hjälp av en impedans-baserade realtidscellanalys (RTCA) system som tillät oss att etablera dos-intervall, som lämpar sig för efterföljande HCS analys (Figur 1). En toxikologisk HCS bedömning utfördes sedan med hjälp av nio flera parametriska endpoints av cellulär toxicitet, varje övervakad vid två tidpunkter (4 och 24 h). Markörerna som användes var indikativ för mitokondriell toxicitet, DNA-skada, stress-kinas, reaktiva syreradikaler (ROS), glutation (GSH) innehåll, kaspas 3-7 aktivitet, cytokrom C frisättning och cellmembranpermeabilitet, såsom beskrivs i Tabell 1.
Vår strategi aktiverat identifiering och karakterisering av effekten av cigarettrök beståndsdelar genom dos- och tidsberoende provtagning. I slutändan, producerade detta ett in vitro toxikologiska profilen för varje HPHC. Multi-liknande områden metoder kan även användas för att ytterligare komplettera HCS-analys. Detta skulle slutligen också ge en djupare förståelse av effekterna på cellsignalering och / eller transkriptionsnivå.
Behovet av alternativ till djurförsök och för nya hög genomströmning testning tillvägagångssätt har diskuterats under de senaste åren. Detta har lett forskare och myndigheter att undersöka alternativa metoder för att testa standard toxicitet, som utnyttjar cellulära analyser som nära efterliknar fysiologi målvävnader. I denna studie har vi visat användbarheten av att kombinera en realtidscell analysator (RTCA) med en hög halt screening (HCS) plattform för att bedöma effekterna av exponering för enskilda CS beståndsdelar på humana lungepitelceller. Denna inställning skulle kunna tillämpas analogt för att utvärdera cytotoxiciteten som induceras av olika andra luftföroreningar, luftburna partiklar och nanopartiklar. Dessutom kan de erhållna resultaten matchas med de från hel-genomet transkriptomik och beräkningsmetoder baserade på orsaks biologiska nätverk. Som tidigare rapporterats, detta tillvägagångssätt tillät oss att bekräfta uppgifter om molekylärstörning på CS exponering 5 med HCS ändpunkter, ta itu med dessa pathway störningar också fenotypiskt.
Som ett flödesschema analys i realtid cellanalys cellviabilitet relaterad information på ett dos- och tidsberoende upplösning, vilket ger bättre beslutsfattande vilken dos och exponerings tidpunkt kan vara gynnsamt för nedströms analys 14. Principen om analysatorn bygger på förändringar i elektriska impedansen genereras av celler som de fäster och sprids på en odlingsbrunn yta täckt med en guldmikroelektrod. Impedansen omvandlas till en dimensionslös parameter med namnet cell-index, vilket kan användas för att övervaka cellvidhäftning, fördelning, morfologi och slutligen cellviabilitet. Även om denna teknik inte ger information om cytotoxiska mekanismer möjliggör detektion av morfologiska cellförändringar även vid mycket låga doser där HCS är inte informativ dess känslighet (data ej visade). Baserat på PREVíka experiment har vi noterat att RTCA metoden kan upptäcka morfologiska förändringar vid lägre doser jämfört med HCS endpoints.
Efter inledande screening med realtidscell analysator, var en HCS plattform som används för att få mer detaljerad information om vilken typ av cytotoxicitet framkallad av varje HPHC. HCS analys panel tillåts att profilera HPHCs mot deras potentiella inverkan på cellulära fack / organeller samt att identifiera de framkalla genotoxicitet eller oxidativ stress. Analysen visade tydliga profiler där de utvalda HPHCs inducerar cytotoxicitet i NHBE celler. I allmänhet samtliga föreningar, utom Fenol, befanns inducera nekros vid de högsta testade doserna. I överensstämmelse med en potentiell roll i utvecklingen av cancer en-aminonaphtalene inducerad fosforylering av H2AX som en markör för genotoxicitet, men HCS panelen också avslöjats aktiviteten hos detta HPHC i mitokondriell toxicitet avläsning (massa ökade och cytokrom C ReleaSE) och oxidativ stress (GSH utarmning). På samma sätt som tidigare beskrivits, var Fenol identifierades att inducera mitokondriell dysfunktion och ge DNA-skador samt GSH utarmning. Krom (VI), en av de föreningar som klassificeras som grupp I cancerframkallande, och Krotonaldehyd också båda identifierats som genotoxiska, särskilt krom (VI) också inducerad apoptos (caspase kaskad aktivering) och Krotonaldehyd orsakade ökad ROS generation. Slutligen Arsenik (V), befanns inducera cJun fosforylering som är en markör för spänningskinasvägen aktivering.
I denna studie, utnyttjade vi NHBE celler som en modell för lungepitelceller in vitro. Med hjälp av dessa celler i en HCS inställning är utan motstycke och möjliggjorde undersökning av ett bredare utbud av endpoints, inklusive genotoxicitet och oxidativ stress markörer. Både levande cell och fasta cellfärgning tillvägagångssätt beskrevs i våra protokoll, visar flexibiliteten av den totala tekniken. i fhandling, kan mycket samma protokoll tillämpas på ett bredare spektrum av mål, som kan åtgärdas genom användning av något fluorescerande färgämne eller antikropp. För ett framgångsrikt genomförande av de levande färgningsprotokoll, är det viktigt att respektera inkubationstiden, som en del av färgämnena har en begränsad halveringstid och fluorescenssignalen kan minska innan bilden förvärvet är genomfört. Det är också viktigt att beakta att om en annan celltyp användes, alla färgnings villkor bör utvärderas på nytt, som den optimala färgämneskoncentrationen och inkuberingstiden kan vara olika.
I det nuvarande pappers har vi beskrivit ett scenario där endast fem föreningar där screenas med HCS metoden. Med tanke på den tidigare beskrivna plattslayouten, de doseras över två olika plattuppsättningar för totalt 24 plattor (6-analyser och 2 tid-punkter) .Det antal plattor kan också ökas, vilket möjliggör en samtidig screening av flera föreningar eller de undersökdersökning av flera endpoints. Innan detta sker dock bör man ta hänsyn till att vissa endpoints (GSH och ROS) kräver omedelbar förvärv, och som en konsekvens, bör utföras doseringen av plattorna i en sicksack sätt för att möjliggöra förvärv av föregående plattan. Å andra sidan, med hjälp av en fast cellfärgningsprotokollet representerar en fördel eftersom plattorna kan staplas, att avbryta protokoll vid vilket steg som helst efter fixeringen, för slutförande av färgningsproceduren i ett senare skede. Detta tillvägagångssätt, till exempel, skulle ge operatören tid att slutföra alla levande cell färgning plattor utan att kompromissa med kvaliteten på uppgifterna.
För att ytterligare optimera arbetsflödet genom att minska antalet plattor, skulle det också vara möjligt att multiplexera flera endpoints tillsammans. Till exempel i det här sammanhanget DNA-skador och stress kinas kan undersökas tillsammans att bara använda två sekundär antikropp med fluorokromer som emitterar i olika channels. Kontinuerlig utveckling av HCS-plattformen, inklusive fullt automatiserad cellsådd, förening utspädning, dosering och färgning, samt tillägg av nya endpoints kommer att ytterligare utöka förmågan hos HCS plattformen som ett kraftfullt profileringsverktyg för HPHCs på epiteliala och andra celltyper .
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Karsta Luettich och Grégory Vuillaume för sin granskning av manuskriptet.
Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader | Thermo | N01-0002B | |
xCelligence RTCA MP | ACEA | 05331625001 | |
Screener (HCS) | Genedata | NA | |
CASY counter TTC | Roche | 05 651 719 001 | |
e-Plates VIEW 96 | ACEA | 06 472 451 001 | |
RTCA Frame 96 | ACEA | 05232392001 | |
RTCA Cardio Temperature Tool | ACEA | 2801171 | |
Plate sealer breathseal | Greiner bio-one | 676051 | |
Normal Human Bronchial Epithelial cells (NHBE) | Lonza | CC-2540 | non-smoking 60-year-old Caucasian male donor |
BEGM BulletKit | Lonza | CC-3170 | Warm at 37 °C before use |
ReagentPack Subculture Reagents kit | Lonza | CC-5034 | Warm at 37 °C before use |
Penicillin/Streptomycin (100x) | Corning | 30-002-CI | |
Easy Flask filter cap 75cm2 | Thermo Scientific | 12-565-349 | |
96 well assay plate black | Corning | 3603 | |
Hoechst 33342 | Fisher Scientific | PI-62249 | |
Draq5 (For Far Red Nuclear Staining) | Biostatus | DR50200 | |
Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CMXRos | Life technologies | M-7512 | |
Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CM-H2XRos | Life technologies | M-7513 | |
ROS Dye: Dihydroethidium | Sigma | D7008 | |
ROS Dye: CellROX | Life technologies | C10422 | |
ROS Dye: MitoSOX | Life technologies | M36008 | |
GSH Dye: Monochlorobimane | Sigma | 69899 | Toxic |
GSH Dye: Monobromobimane | Life technologies | M-1378 | Toxic |
Membrane permeability Dye: YO-PRO-1 | Life technologies | Y3603 | Irritating |
Membrane permeability Dye: TO-PRO-1 | Life technologies | T3602 | Irritating |
Membrane permeability Dye: TOTO-1 | Life technologies | T3600 | Irritating |
Caspase Dye: Cellevent Caspase 3/7 green | Life technologies | C10423 | Irritating |
Anti-Cytochrome C antibody (Mouse) | Thermo | MA5-11823 | |
Anti-phospho-c-Jun antibody (Mouse) | Thermo | MA5-15889 | |
Anti-phospho-H2AX antibody (Mouse) | Thermo | MA1-2022 | |
Goat anti-Mouse IgG DyLight 650 | Abcam | ab96878 | |
10X permeabilization buffer | Fisher | 8408400 | |
4% Formaldehyde solution | Sigma | F1635 | Toxic |
10X blocking buffer | Fisher | 8408500 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
Hanks' Balanced Salt solution | Sigma | H8264 | |
Staurosporine | Sigma | S4400 | Toxic |
Valinomycin | Sigma | V0627 | Toxic |
Paraquat | Sigma | 36541 | Toxic |
Anisomycin | Sigma | A9789 | Toxic |
Ethacrynic acid | Sigma | E4754 | Toxic |
1-Aminonaphthalene | Sigma | 34390 | Toxic |
2-Nitropropane | Sigma | 130265 | Toxic |
Acetamide | Sigma | 695122 | Toxic |
Acetone | Sigma | 650501 | Toxic |
Acrylamide | Sigma | A9099 | Toxic |
Arsenic (V) | Sigma | A6756 | Toxic |
Benzene | Sigma | 12540 | Toxic |
Chromium (VI) | Sigma | 216623 | Toxic |
Crotonaldehyde | Sigma | 262668 | Toxic |
Methyl ethyl ketone | Sigma | 34861 | Toxic |
Nickel | Sigma | 203866 | Toxic |
Nitrobenzene | Sigma | 48547 | Toxic |
Phenol | Sigma | P5566 | Toxic |
Quinoline | Sigma | 241571 | Toxic |
Toluene | Sigma | 34866 | Toxic |