Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Bruke optiske fibre
Summary
Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.
Abstract
Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.
Introduction
Dråpe MicroFluidics gi en plattform for høy gjennomstrømming biologi ved compartmentalizing eksperimenter i et stort antall vanndråper suspendert i en transportør olje 1. Dråpene har vært brukt i anvendelser så forskjellige som enkelt celle analyse 2, digital-polymerase kjedereaksjon (PCR) 3, og enzymet evolusjon 4. Fluorescent analysene er standard modus for gjenkjenning for dråpe MicroFluidics, som sine lyse signaler og rask tid respons er kompatible med påvisning av sub-nanoliter dråpevolum på kHz priser. Mange programmer krever fluorescens deteksjon i minst to farger samtidig. For eksempel vårt laboratorium som vanligvis utfører PCR-aktivert dråpe sortering eksperimenter som bruker en deteksjonskanal for resultatet av en analyse, og bruker et sekundært bakgrunn fargestoff for å gjøre analysen-negative dråpe tellbar 5.
Typiske deteksjon stasjoner for dråpe MicroFluidics er based på epifluorescence mikroskop, og krever komplisert lette manipulasjoner ordninger for å innføre eksitasjon lys fra frie plass lasere i mikroskop for å være fokusert på prøven. Etter fluorescens avgis fra en dråpe, er det emitterte fluorescerte lyset filtreres slik at hver deteksjons kanal benytter en fotomultiplikatorrøret (PMT) sentrert på et bølgelengdebånd. Epifluorescence mikroskop-basert optisk deteksjonssystemer gir en barriere for å komme på grunn av deres bekostning, kompleksitet, og nødvendig vedlikehold. Optiske fibre gir mulighet til å konstruere en forenklet og robust deteksjon ordningen, ettersom fibre kan manuelt innføres i microfluidic enheter, fjerner behovet for speilbasert lys ruting, og slik at lysbanene til å kobles sammen ved bruk av fiberoptiske kontakter.
I denne artikkelen beskriver vi montering og validering av en kompakt og modulær ordningen for å utføre flerfarget fluorescens deteksjon ved å utnytte en rekke optiske fibre enda enkelt fotodetektoren 6. Optiske fibre er koplet til individuelle lasere og er satt normal til en L-formet strømningskanal med jevne romlige forskyvninger. En fluorescens samling fiber er orientert parallelt med eksitasjon regionene og er koblet til en enkelt PMT. Fordi en dråpe passerer gjennom laserstrålen ved forskjellige tidspunkter, data registrert ved PMT viser en tidsforskyvning som gjør det mulig for brukeren å skille mellom fluorescensen avgitt etter at dråpen er eksitert ved hver distinkt laserstrålen. Denne tidsmessige forskyvning eliminerer behovet for å skille lys som utsendes til separate PMTs ved hjelp av en serie av dikroiske speil og båndpassfiltere. For å bekrefte effektiviteten av detektoren, kvantitere vi fluorescens i dråpe populasjoner innkapsle fargestoffer av forskjellig farge og konsentrasjon. Følsomheten til systemet blir undersøkt for én farge fluorescein deteksjon, og viser evne til å påvise dråper med konsentrasjoner ned til 0,1 nM, en 200x følsomhet improvement sammenlignet med de senere fiberbaserte tilnærminger som er rapportert i litteraturen 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fiberoptisk påvisning krever innretting av optiske fibre med hensyn til væskekanaler. Fordi vår enhet benytter føringskanaler fabrikkert med flerlags fotolitografi, plassering av masker i forhold til hverandre er av stor betydning. Dersom fiberføringskanalene er for nær fluidkanalen, er det en potensiell fare for væskelekkasje; hvis føringskanalene er plassert for langt borte eller feiljustert, kan fluorescens signal ufarlig for påvisning fiber bli betydelig redusert. Riktig justering kan bli hjulpet ved å utf…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by DARPA grant number 84389.01.44908, an NSF CAREER award (DBI-1253293), an NIH exploratory/developmental research grant (CA195709), and NIH New Innovator Awards (HD080351, DP2-AR068129-01), and a New Directions grant from the UCSF resource allocation program.
Materials
| Photomasks | CadArt Servcies | ||
| 3" silicon wafers, P type, virgin test grade | University Wafers | 447 | |
| SU-8 3035 | Microchem | Y311074 | |
| SU-8 2050 | Microchem | Y111072 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Krayden | 4019862 | |
| 1 ml syringes | BD | 309628 | |
| 10 ml syringes | BD | 309604 | |
| 27 gaugue needles | BD | 305109 | |
| PE 2 polyethylene tubing | Scientific Commodities, Inc. | B31695-PE/2 | |
| Novec 7500 | Fisher Scientific | 98-0212-2928-5 | Commonly knowns as HFE 7500 |
| Ionic Krytox Surfactant | Synthesis instructions in ref #10 | ||
| Dextran- conjugated cascade blue dye | Life Technologies | D-1976 | |
| Fluorescein sodium salt | Sigma | 28803 | |
| Quad bandpass filter | Semrock | FF01-446/510/581/703-25 | |
| PMT | Thorlabs | PMM02 | |
| Fiber port | Thorlabs | PAFA-X-4-A | |
| lens tube | Thorlabs | SM1L05 | |
| Patch cable with 200 um core / 225 um cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector | Thorlabs | Custom | |
| Patch cable with 105 um core / 125 um cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector | Thorlabs | Custom | |
| 125 um fiber stripping tool | Thorlabs | T08S13 | |
| 225 um fiber stripping tool | Thorlabs | T10S13 | |
| laser fiber adapter | OptoEngine | FC/PC Adapter | |
| 405 nm CW laser at 50 mW | OptoEngine | MDL-III-405 | Distributor for CNI lasers |
| 473 nm CW laser at 50 mW | OptoEngine | MLL-FN-473-50 |
References
- Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab Chip. 8, 198-220 (2008).
- Mazutis, L., Gilbert, J., Ung, W. L., Weitz, D. A., Griffiths, A. D., Heyman, J. A. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nat Protocol. 8 (5), 870-891 (2013).
- Hindson, B. J., Ness, K. D. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem. 83, 8604-8610 (2011).
- Agresti, J. J., Antipov, E. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (14), 4004 (2010).
- Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Picoinjection Enables Digital Detection of RNA with Droplet RT-PCR. PLOS ONE. 8 (4), (2013).
- Cole, R. H., de Lange, N., Gartner, Z. J., Abate, A. R. Compact and modular multicolour fluorescence detector for droplet microfluidics. Lab Chip. 15 (13), 2754-2758 (2015).
- Guo, F., Lapsley, M. I. A droplet-based, optofluidic device for high-throughput, quantitative bioanalysis. Anal Chem. 84, 10745-10749 (2012).
- . Lithography Available from: https://www.memsnet.org/mems/processes/lithography.html (2015)
- DeJournette, C. J., Kim, J., Medlen, H., Li, X., Vincent, L. J., Easley, C. J. Creating Biocompatible Oil-Water Interfaces without Synthesis: Direct Interactions between Primary Amines and Carboxylated Perfluorocarbon Surfactants. Anal Chem. 85 (21), (2013).
- Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution. Lab Chip. 12, 882 (2012).
- Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Ultrahigh-Throughput Mammalian Single-Cell Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction in Microfluidic Drops. Anal Chem. 85 (16), 8016-8021 (2013).
- Martini, J., Recht, M. I., Huck, M., Bern, M. W., Johnson, N. M., Kiesel, P. Time encoded multicolor fluorescence detection in a microfluidic flow cytometer. Lab Chip. 12 (23), 5057-5062 (2012).
- Bliss, C. L., McMullin, J. N., Backhouse, C. J. Rapid fabrication of a microfluidic device with integrated optical waveguides for DNA fragment analysis. Lab Chip. 7 (10), 1280-1287 (2007).
- Martinez Vazquez, R., Osellame, R. Optical sensing in microfluidic lab-on-a-chip by femtosecond-laser-written waveguides. Anal Bioanal Chem. 393, 1209-1216 (2009).
- Vishnubhatla, K. C., Bellini, N., Ramponi, R., Cerullo, G., Osellame, R. Shape control of microchannels fabricated in fused silica by femtosecond laser irradiation and chemical etching. Opt Express. 17 (10), 8685-8695 (2009).
