Multifluorescensdetektion för dropp Mikrofluidik Använda optiska fibrer
Summary
Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.
Abstract
Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.
Introduction
Dropp mikrofluidik tillhandahålla en plattform för hög genomströmning biologi genom compartmentalizing experiment i ett stort antal vattenhaltiga droppar suspenderade i en bärare olja 1. Droppar har använts för tillämpningar som varierade som enda cell analys 2, digital polymerase chain reaction (PCR) 3, och enzym evolution 4. Fluorescerande analyser är standardläget för upptäckt för dropp mikrofluidik, eftersom deras ljusa signaler och snabb svarstid är kompatibla med detektering av sub-nanoliter droppvolym på kilohertz priser. Många applikationer kräver fluorescensdetektion i minst två färger samtidigt. Exempelvis utför vårt labb vanligen PCR-aktiverade droppsorteringsexperiment som använder en detekteringskanal för resultatet av en analys, och använder en sekundär bakgrund färgämne för att göra analysen negativa dropp kvantifierbart 5.
Typiska detekteringsstationer för dropp mikrofluidik är based på epifluorescence mikroskop, och kräver komplicerade ljus manipulationer system för att införa excitationsljus från fria rymden lasrar i mikroskop för att fokuseras på provet. Efter fluorescens avges från en droppe, är det emitterade fluorescerande ljuset filtreras så att varje detekteringskanal använder ett fotomultiplikatorrör (PMT) centrerad på en våglängdsband. Epifluorescensmikroskop baserade system optisk detekterings ge ett hinder för inträde på grund av deras bekostnad, komplexitet och underhåll krävs. Optiska fibrer ger möjlighet att bygga en förenklad och robust detektionsschema, eftersom fibrer kan manuellt in i mikroflödessystem enheter, tar bort behovet av spegel baserad ljus routing, och låta ljusvägar kan gränssnitt med hjälp av fiberoptiska kontaktdon.
I detta dokument beskriver vi montering och validering av en kompakt och modulärt system för att utföra multifluorescensdetektion genom att använda en rad optiska fibrer enda enda fotodetektor 6. Optiska fibrer är kopplade till individuella lasrar och infogas normalt till en L-formad flödeskanal med jämna rumsliga förskjutningar. En fluorescensuppsamlingsfiber är orienterad parallellt med exciterings- regionerna och är ansluten till en enda PMT. Eftersom en droppe passerar genom laserstrålarna vid olika tider, uppgifter som registrerats av PMT visar en tidsmässig förskjutning som tillåter användaren att skilja mellan fluorescens som emitteras efter droppen exciteras av en och samma laserstråle. Denna tids förskjutning eliminerar behovet av att separera utsända ljuset att separera PMTs med hjälp av en rad dikroitiska speglar och bandpassfilter. För att validera effektiviteten av detektorn, kvantifiera vi fluorescens i dropp populationer inkapslande färgämnen av olika färg och koncentration. Känsligheten hos systemet undersöks för enfärgade fluorescein detektering, och visar förmåga att upptäcka droppar med koncentrationer ned till 0,1 nM, en 200x känslighet improvement jämfört med senaste fiberbaserade metoder som rapporterats i litteraturen 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fiberoptiska detektions kräver anpassning av optiska fibrer med avseende på vätskekanaler. Eftersom vår enhet använder styrkanaler tillverkade med flerskiktsfotolitografi, är placeringen av masker med avseende på varandra av stor betydelse. Om de fiberstyrkanalerna är för nära fluidkanalen, finns det en potential för fluidläckage; om styrkanalerna är placerade för långt bort eller snett, kan fluorescenssignalen som samlats in av detekteringsfiber minskas avsevärt. Korrekt placering kan underlättas genom…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by DARPA grant number 84389.01.44908, an NSF CAREER award (DBI-1253293), an NIH exploratory/developmental research grant (CA195709), and NIH New Innovator Awards (HD080351, DP2-AR068129-01), and a New Directions grant from the UCSF resource allocation program.
Materials
| Photomasks | CadArt Servcies | ||
| 3" silicon wafers, P type, virgin test grade | University Wafers | 447 | |
| SU-8 3035 | Microchem | Y311074 | |
| SU-8 2050 | Microchem | Y111072 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Krayden | 4019862 | |
| 1 ml syringes | BD | 309628 | |
| 10 ml syringes | BD | 309604 | |
| 27 gaugue needles | BD | 305109 | |
| PE 2 polyethylene tubing | Scientific Commodities, Inc. | B31695-PE/2 | |
| Novec 7500 | Fisher Scientific | 98-0212-2928-5 | Commonly knowns as HFE 7500 |
| Ionic Krytox Surfactant | Synthesis instructions in ref #10 | ||
| Dextran- conjugated cascade blue dye | Life Technologies | D-1976 | |
| Fluorescein sodium salt | Sigma | 28803 | |
| Quad bandpass filter | Semrock | FF01-446/510/581/703-25 | |
| PMT | Thorlabs | PMM02 | |
| Fiber port | Thorlabs | PAFA-X-4-A | |
| lens tube | Thorlabs | SM1L05 | |
| Patch cable with 200 um core / 225 um cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector | Thorlabs | Custom | |
| Patch cable with 105 um core / 125 um cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector | Thorlabs | Custom | |
| 125 um fiber stripping tool | Thorlabs | T08S13 | |
| 225 um fiber stripping tool | Thorlabs | T10S13 | |
| laser fiber adapter | OptoEngine | FC/PC Adapter | |
| 405 nm CW laser at 50 mW | OptoEngine | MDL-III-405 | Distributor for CNI lasers |
| 473 nm CW laser at 50 mW | OptoEngine | MLL-FN-473-50 |
References
- Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab Chip. 8, 198-220 (2008).
- Mazutis, L., Gilbert, J., Ung, W. L., Weitz, D. A., Griffiths, A. D., Heyman, J. A. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nat Protocol. 8 (5), 870-891 (2013).
- Hindson, B. J., Ness, K. D. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem. 83, 8604-8610 (2011).
- Agresti, J. J., Antipov, E. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (14), 4004 (2010).
- Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Picoinjection Enables Digital Detection of RNA with Droplet RT-PCR. PLOS ONE. 8 (4), (2013).
- Cole, R. H., de Lange, N., Gartner, Z. J., Abate, A. R. Compact and modular multicolour fluorescence detector for droplet microfluidics. Lab Chip. 15 (13), 2754-2758 (2015).
- Guo, F., Lapsley, M. I. A droplet-based, optofluidic device for high-throughput, quantitative bioanalysis. Anal Chem. 84, 10745-10749 (2012).
- . Lithography Available from: https://www.memsnet.org/mems/processes/lithography.html (2015)
- DeJournette, C. J., Kim, J., Medlen, H., Li, X., Vincent, L. J., Easley, C. J. Creating Biocompatible Oil-Water Interfaces without Synthesis: Direct Interactions between Primary Amines and Carboxylated Perfluorocarbon Surfactants. Anal Chem. 85 (21), (2013).
- Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution. Lab Chip. 12, 882 (2012).
- Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Ultrahigh-Throughput Mammalian Single-Cell Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction in Microfluidic Drops. Anal Chem. 85 (16), 8016-8021 (2013).
- Martini, J., Recht, M. I., Huck, M., Bern, M. W., Johnson, N. M., Kiesel, P. Time encoded multicolor fluorescence detection in a microfluidic flow cytometer. Lab Chip. 12 (23), 5057-5062 (2012).
- Bliss, C. L., McMullin, J. N., Backhouse, C. J. Rapid fabrication of a microfluidic device with integrated optical waveguides for DNA fragment analysis. Lab Chip. 7 (10), 1280-1287 (2007).
- Martinez Vazquez, R., Osellame, R. Optical sensing in microfluidic lab-on-a-chip by femtosecond-laser-written waveguides. Anal Bioanal Chem. 393, 1209-1216 (2009).
- Vishnubhatla, K. C., Bellini, N., Ramponi, R., Cerullo, G., Osellame, R. Shape control of microchannels fabricated in fused silica by femtosecond laser irradiation and chemical etching. Opt Express. 17 (10), 8685-8695 (2009).
