체외 식민지 분석 실험에서 트라이 강력한 전구 세포를 특성화를위한 성인 쥐 췌장에서 분리
Summary
자기 갱신 성인 쥐의 췌장으로부터 분리 전구 세포의 분화를 검출하는 시험 관내 콜로니 검정 고안되어있다. 이러한 분석에서, 췌장 전구 세포가 메틸 – 함유 반고체 배지에서 3 차원 공간에서 세포 콜로니를 야기. 단일 세포와 개별 식민지의 특성을 처리하기위한 프로토콜이 설명되어 있습니다.
Abstract
줄기 성인 췌장 전구 세포가 제 1 형 당뇨병 환자를 치료하기위한 치료제 베타 – 유사 세포의 잠재적 인 원인이 될 수있다. 줄기 및 전구 세포를 성인 췌장에 존재하는지 그러나, 아직 알려져 있지 않다. 성인 쥐 계통 추적 CRE-LOX를 사용하여 연구 전략 지원 또는 중 베타 세포 덕트 성인 췌장 전구 세포가 존재할 수있다 추정 위치에서 생성 될 수 있다는 생각을 반박한다는 결과를 수득 하였다. 이러한 생체 CRE-LOX 계보-추적 방법은, 그러나, 자기 갱신과 줄기 세포를 정의하는 데 필요한 멀티 혈통 분화 두 가지 기준의 질문에 대답 할 수 없습니다. 이 기술 격차를 해결하기 위해, 우리는 췌장 전구 세포에 대한 3 차원 식민지 분석을 고안했다. 곧 우리의 초기 발행 후, 다른 연구소는 독립적으로 organoid 분석라는 비슷하지만 동일하지, 방법을 개발했다. organoid 검정에 비해, 우리의 방법을 사용낮은 농도에서 세포 외 기질 단백질의 포함을 허용 점성 용액을 형성하는 메틸. 많은 성인 장기 줄기 세포의 경우, 상기 메틸 – 함유 분석은 쉽게 검출 및 선조 작은 서브 모집단을 구성 할 때 중요한 단일 세포 수준에서 선조 세포의 분석을 허용한다. 함께, 여러 실험실에서 결과는 마우스의 췌장 전구와 같은 세포의 체외 자기 갱신 및 멀티 혈통 분화에 보여줍니다. 현재의 프로토콜을 마우스 췌장 전구 세포의 특징을 두 메틸 계 콜로니 검정을 기술; 하나는 라미닌 하이드로 알려진 뮤린 세포 외 기질 단백질의 상업적 제조 및 다른 인공 세포 외 기질 단백질을 포함한다. 여기에 도시 된 기술은 1)은 췌장의 해리 CD133 + Sox9 / EGFP의 정렬 성체 생쥐 + 도관 셀은 S 2) 단일 세포 조작이다orted 세포, 3) 단일 콜로니는 자기 갱신 또는 차별화를 평가하기 위해 보조 식민지 분석에 미세 유체 QRT-PCR 및 전체 마운트 면역 염색 및 단일 세포 현탁액 및 재 도금에 차 식민지 4) 분리를 사용하여 분석한다.
Introduction
췌장은 세 가지 주요 세포 계통으로 구성된다; 선포 세포는 소화 효소가, 덕트가 병원균을 방어하고 장내에 소화 효소를 수송하는 점액 분비 분비 및 내분비 세포는 포도당 항상성을 유지하는 인슐린과 글루카곤을 포함한 호르몬을 분비. 췌장의 배아 발달 동안 초기 도관 세포는 성체 동물의 1,2- pancreata에서 세 계통 상승을 제공 할 수있는 트라이 강력한 선조 세포의 근원이다. 골수 줄기 세포와 같은 성체 줄기 세포 및 선조 세포는 이미 성공적으로 각종 질병 (3)을 치료하는 데 사용되기 때문에, 성인 췌장 줄기 및 전구 세포를 찾는데 큰 관심이있다. 분리 및 성인 췌장 줄기 및 전구 세포의 조작이 가능하다면,이 세포는 인슐린 분비 세포가자가 면역에 의해 파괴되는 제 1 형 당뇨병 등의 질병을 치료하는 데 사용할 수 있습니다.
<p class = "jove_content"> 배아 개발의 완료가 많이 과학계에서 논의되는 질문 후 트라이 강력한 전구 세포는 여전히 성인 췌장 관에 존재 여부. 이 토론에서, 그리고 사용하여 생체 CRE-LOX 계보 – 추적 기술을,이나 다와 동료 마커, 탄산 탈수 효소 II 표지 성인 쥐 도관 세포, 세 췌장 계통 (4)을 야기 할 수 있음을 보여 주었다. 그러나, 이러한 HNF1b 5 Sox9이 다른 도관 마커를 이용하면, 도관 세포는 성체 생쥐에서 베타 세포의 주요 원인없는 것으로 결론 지어졌다.몇 년 전에, 우리는 전술 논쟁의 원인은 필요한 자기 갱신 멀티 혈통 분화 개의 조건을 측정하는데 사용될 수있는 적절한 분석 도구의 필드 -6,7-에서 부족에 기인 할 수 있음을 제안 줄기 세포를 정의합니다. 언급 된 생체 CRE-LOX 계보 – 추적 기술위의 인구 수준에서 조상 – 자손 관계에 대한 증거를 제공 할 수 있습니다. 그러나,이 혈통 추적 기술은 단일 전구 세포는 자기 갱신과 여러 계통으로 분화 할 수 있는지 여부를 식별하기 위해 힘 제한된다. 여러 모노 강력한 조상, 다른 혈통 잠재력이 각각 함께 분석 하였다 경우, 그들은 집단적으로 멀티 혈통 분화 능력을 가지고 나타날 수 있기 때문에 단일 세포 분석은 중요하다. 또한, 줄기 세포는 일반적으로 성숙한 기관의 작은 집단이다. 작은 세포 집단의 활성은 주요 집단에 의해 마스크 될 수있다. 따라서, 모집단 연구에서 부정 결과가 반드시 줄기 세포의 유무를 나타내지 않는다. 마지막으로, CRE-LOX 계보 추적은 현재 자기 갱신의 측정을 허용하지 않습니다.
췌장 전구 세포 생물학, 식민지의 분야에서 기술 격차를 해결하는 시작하려면 7-11 또는 12-15 organoid </su3D 문화 시스템을 사용하여 페이지> 분석 고안되었다. 췌장 전구 세포에 대한 두 식민지 분석은 우리의 실험실에서 개발 된 하나는 쥐의 세포 외 기질 단백질 (ECM) (방법 및 장비 표 참조)의 상업 준비를 포함, 다른 하나는 라미닌 하이드로 겔, 정의 된 인공 ECM 단백질 7-11 포함되어 있습니다. 전구 세포는 반고체 배지 함유 메틸 혼합한다. 메틸 목재 섬유로 제조 된 생물학적 불활성 점성 재료이고, 통상적으로 조혈 콜로니 분석 (16)에 사용되어왔다. 그들은 다시 집합체 수 없도록 메틸 – 함유 반고체 배지 단일 전구 세포의 이동을 제한한다. 그러나, 상기 매체가 전구 세포의 성장과 3 차원 공간에서 세포의 콜로니로 분화 할 수 있도록 충분히 부드러운 것이다. 혈액학의 전통에 따라, 세포의 식민지에 상승을 제공 할 수있는 선수는 췌장 전구 세포는 N이었다아메드 췌장 집락 형성 단위 (PCFU). 뮤린 ECM 함유 콜로니 에세이에서 성장시 PCFUs는 "링"콜로니 7 명명 낭성 콜로니를 야기. 의 Wnt 작용제를 첨가하면, R-spondin1는 쥐 ECM 함유 문화로, 일부 링 식민지는 "밀도"식민지 7 차례. 이 기사에서는 쥐 ECM 문화에서 자란 식민지의 두 가지 유형은 모두 "반지 / 밀도"식민지라고합니다. 벨소리 / 고밀도 콜로니가 단일 세포 현탁액 내로 해리 라미닌 하이드로 겔을 함유 배양에 재 플레이 팅하는 경우 "내분비 / 선포"7 콜로니를 형성한다.
하나의 식민지 분석을 사용하여, 9 쥐의 췌장, 중 성인에서 (2-4개월 된) 7,11 또는 젊은 (1 주령) 링 / 밀도 및 내분비 / 선포 식민지의 대부분, 세 가지를 모두 표현하는 것으로 나타났습니다 혈통 마커. 이것은 원래 PCFUs 대부분 트라이 강력한 것을 시사. 쥐 ECM 함유 식민지 분석에서, 성인 쥐 PCFUs 견고하게 자기 갱신과 문화 7 11 주 동안 약 50 만 회를 확장합니다. 라미닌 하이드로 겔의 존재, 쥐 PCFUs는 내분비 및 선포 세포로 우선적으로 분화하도록 권장하고 유관 계통 7,9,11 너무 적은 반면 쥐 ECM은 우선적으로, 내분비 및 선포 계통을 통해 도관 세포의 분화를 지원합니다. 중요한 것은, 인슐린 + 글루카곤 – 모노 – 호르몬 세포 라미닌 하이드로 배양 생성 기능 성숙 시사 7,9 관내에서 자극 글루코오스에 반응의 인슐린을 분비한다. 7,9 잠재적 인 트라이 혈통 차별화와 개별 PCFUs의 자기 갱신 (11)는 콜로니 형성을 위해 잘 당 하나의 세포를 배양, 단일 셀의 미세 조작, 즉에 의해 확인된다. 함께, 이러한 결과는 자기 갱신, 트리 poten 존재한다는 증거를 제시t, 3D 문화 활동을 보여 출생 후의 쥐의 췌장 전구와 같은 세포.
이 문서에서 설명하는 쥐 PCFU 분석은 쥐의 배아 줄기 세포 (mESCs) 17에서 차별화 된 전구 세포 위해 설계된 이전의 식민지 분석에서 파생됩니다. 즉, 프로토콜은 다른 조브 간행물 (18)에 자세히 설명되어 있습니다. 배양 성분 성인 PCFUs 대한 뮤린 ECM 함유 콜로니 에세이를 수행하는데 필요한 기술은 MESC – 유래 전구 세포 (17, 18)와 동일하다. 따라서, 이러한 분석의 측면은 여기서 반복되지 않을 것이다; 대신 다음 절차는 해결 될 것입니다 : 1) 성인 췌장의 해리 성인 마우스 7, 2) 정렬 된 세포의 단일 세포 조작, 3) 단일 식민지에서 PCFUs을 풍요롭게 CD133 + Sox9 / EGFP + 도관 세포를 정렬 미세 유체 QRT-PCR 및 전체 마운트 면역 염색 및 콜로니 4) 분리를 사용하여 분석단일 세포 현탁액과로의 쥐 ECM 또는 라미닌 하이드로 겔 식민지 분석에 재 도금.
Protocol
Representative Results
Discussion
췌장 식민지 분석 및 단일 콜로니는 여기에 설명 분석 지난 수십 년 23 조혈 전구 세포의 생물학을 해독에서 중요한 역할을 한 메틸 셀룰로오스 함유 조혈 식민지 분석에 의해 영감을했다. 이 분석에서 (그림 5), 췌장 세포로 도금 해리 메틸 셀룰로오스 함유 링, 밀도 또는 내분비 / 선포 식민지 (7)의 형성을 지원하는 적절한 성장 인자와 ECM 단백질과 반 고형 미디어를. ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 정렬에 도움을 희망의 도시에서 분석 세포 계측법 코어에서 루시 브라운과 알렉산더 Spalla 감사합니다. 이 작품은 건강 (NIH)의 국립 연구소 DAT 지지대에 재생 의학 부여 RB5-07398에 대한 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 부여 NSF-DMR-1206121 캘리포니아 연구소 R01DK081587 및 R01DK099734 HTK, 그리고 ADR에 U01DK089533 및 부여에 의해 부분적으로 지원 HTK 푸에르 테 재단과 엘라 피츠 제럴드 재단의 조셉 J. 제이콥스 DAT에 캘리포니아 공과 대학에서 의학 분자 공학 연구소, 이들로부터 감사 인정도 있습니다.
자금 조달 :이 작품은 건강 (NIH)의 국립 연구소에 의해 부분적으로 지원됩니다 HTK에 R01DK081587 및 R01DK099734을 부여하고, ADR에 U01DK089533, 그리고에 재생 의학 부여 RB5-07398에 대한 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 부여 NSF-DMR-1206121 캘리포니아 연구소 DAT는 조셉 J. 제이콥스에서 지원DAT에 캘리포니아 공과 대학에서 의학 분자 공학 연구소와 옥스 나드 재단과 HTK에 엘라 피츠 제럴드 재단들도 기꺼이 인정한다. 이 책에서보고 된 연구는 보너스 번호 P30CA33572에서 국립 보건원의 국립 암 연구소 (National Cancer Institute)에 의해 지원되는 분석 세포 계측법 코어 및 광학 현미경 디지털 이미징 코어에서 수행 한 작업을 포함했다.
연구 스폰서 : 스폰서는 데이터의 연구 설계, 수집, 분석 또는 해석에 참여하지 않았다.
Materials
| Murine ECM proteins (Matrigel) | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 354230 | Stock kept at -20oC |
| Laminin Hydrogel | Provided by David Tirrell (Pasadena, CA USA) | Stock kept at -20oC | |
| Methylcellulose | Shinetsu Chemical (Tokyo, Japan) | 1500 centipoise (dynamic viscosity unit equal to 15g/cm/s) (high viscosity) | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Mediatech (Manassas, VA, USA) | 21-031-CV | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15070-063 | |
| 50mL Flacon Conical vial | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 352070 | |
| 100mmx20mm Suspension culture dish | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 430591 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma (St. Louis, MO, USA) | A8412 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15070-063 | |
| DNase1 | Calbiochem (Darmstadt, Germany) | 260913 | |
| Collagenase B | Roche (CH-4070, Basel, Schweiz, Switzerland) | 11088831001 | Stock kept at -20oC |
| Anti-mouse CD16/32 | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 101310 | low endotoxin, azide free |
| PE-Cy7 Rat IgG2a κ Isotype Control | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 400522 | |
| Rat IgG1 κ Isotype Control | eBioscience (San Diego, CA, USA) | 13-4301-82 | |
| Anti-CD133-Biotin | eBioscience (San Diego, CA, USA) | 13-1331-82 | |
| Anti-CD71-PE-Cy7 | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 113812 | |
| Streptavidin-Allophycocyanin | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 405207 | |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | 3571 | Stock kept at -20oC |
| Anti-mucin 1 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA USA) | HM-1630-P1 | |
| Dylight 649 Goat anti-Armenian Hamster | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 127-495-160 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Mediatech(Manassas, VA, USA) | 10-092-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Tissure Culture Biologicals (Long Beach, CA, USA) | 101 | Stock kept at -20oC |
| Tris Ethylenediaminetetraacetic acid | TEKnova (Hollister, CA, USA) | T0221 | |
| Rneasy Micro Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 74004 | |
| QuantiTec Reverse Transcription Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 205310 | |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | Ambion/Invitrogen(Grand Island, NY, USA) | 11753-100 | |
| Paraformaldehyde | Santa Cruz Bio (Santa Cruz, CA, USA) | SC-281692 | |
| Goat serum | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 005-000-121 | Stock kept at -20oC |
| Donkey serum | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 0017-000-121 | Stock kept at -20oC |
| Triton X-100 | Sigma (St. Louis, MO, USA) | T9284 | |
| Trypsin | Sigma (St. Louis, MO, USA) | T-4799 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | 15575-020 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies (Waltham, MA, USA) | 25200-056 | |
| Sterile Water | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15230-147 | Molecular biology grade |
| Pasteur Pipette | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 13-678-8B | |
| 40um Filter Mesh | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 08-771-1 | |
| 70 um filter mesh | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 08-771-2 | |
| TC Plate 96 Well Suspension | Sarstedt | 83.3924 (Previously 83.1835) | |
| 1cc Syringe | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 309659 | |
| 10cc Syringe | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 301604 | |
| 48.48 Dyanmic Array Chip | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | BMK-M-48.48 | |
| Fluidigm GE 48.48 Dynamic Array Sample & Assay Loading Reagent Kit | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | 85000800 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems (Grand Island, NY, USA) | 4304437 | |
| Polyethylene glycol sorbitan monolaurate | Sigma (St. Louis, MO, USA) | P7949 | |
| Glass Bottom Dish | MatTek (Ashland, MA, USA) | P35G-1.5-14-C | 35 mm petri dish with glass bottom |
| Mouth Piece/ Rubber Tubing | Renova Life Inc. (College Park, MD, USA) | MP-SET | |
| Nicotinamide | Sigma (St. Louis, MO, USA) | N0636 | Stock kept at -20oC |
| Vascular Endothelial Growth Factor | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 293-VE | Stock kept at -80oC |
| Activin B | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 659-AB | Stock kept at -80oC |
| Extendin 4 | Sigma (St. Louis, MO, USA) | E7144 | Stock kept at -20oC |
| Rspondin-1 | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 3474-RS | Stock kept at -80oC |
| Falcon 5mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 352054 | |
| PrecisionGlide Needle 18Gx1 1/2 | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 305196 | |
| PrecisionGlide Needle 16Gx1 1/2 | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 305198 | |
| Costar Ultra-Low Attachment Surface 24 well flat bottom plate | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 3473 | |
| Costar 96 Black Well Plate | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 3603 | Flat, clear bottom with lid. Black polystyrene TC-treated microplates |
| Zeiss LSM510 META NLO Axiovert 200M Inverted Microscope | Carl Zeiss AG (Oberkochen, Germany) | ||
| Biomark HD | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | ||
| Aria Special Order Research Product Cell Sorter | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) |
References
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