Die Verkalkung der glatten Gefäßmuskelzellen und Imaging von Aortic Kalzifizierung und Entzündung

Summary

Vascular calcification is an important predictor of and contributor to human cardiovascular disease. This protocol describes methods for inducing calcification of cultured primary vascular smooth muscle cells and for quantifying calcification and macrophage burden in animal aortas using near-infrared fluorescence imaging.

Abstract

Cardiovascular disease is the leading cause of morbidity and mortality in the world. Atherosclerotic plaques, consisting of lipid-laden macrophages and calcification, develop in the coronary arteries, aortic valve, aorta, and peripheral conduit arteries and are the hallmark of cardiovascular disease. In humans, imaging with computed tomography allows for the quantification of vascular calcification; the presence of vascular calcification is a strong predictor of future cardiovascular events. Development of novel therapies in cardiovascular disease relies critically on improving our understanding of the underlying molecular mechanisms of atherosclerosis. Advancing our knowledge of atherosclerotic mechanisms relies on murine and cell-based models. Here, a method for imaging aortic calcification and macrophage infiltration using two spectrally distinct near-infrared fluorescent imaging probes is detailed. Near-infrared fluorescent imaging allows for the ex vivo quantification of calcification and macrophage accumulation in the entire aorta and can be used to further our understanding of the mechanistic relationship between inflammation and calcification in atherosclerosis. Additionally, a method for isolating and culturing animal aortic vascular smooth muscle cells and a protocol for inducing calcification in cultured smooth muscle cells from either murine aortas or from human coronary arteries is described. This in vitro method of modeling vascular calcification can be used to identify and characterize the signaling pathways likely important for the development of vascular disease, in the hopes of discovering novel targets for therapy.

Introduction

Kardiovaskuläre Erkrankungen sind die häufigste Ursache für Morbidität und Mortalität in der Welt, einschließlich der Vereinigten Staaten , wo es mehr als 780.000 Todesfälle entfallen jährlich. ¹ Koronargefäßverkalkung und Aortaverkalkung sind Markenzeichen von atherosklerotischen Erkrankungen und dienen als starke Prädiktoren für kardiovaskuläre Ereignisse. ^2- Intima – Verkalkung, im Zusammenhang mit Atherosklerose und medial (auch bekannt als Mönckeberg) Verkalkung, im Zusammenhang mit chronischer Nierenerkrankung und Diabetes ⁵ intimale Verkalkung tritt bei der Festlegung der Lipidakkumulation und Makrophagen. ⁴ Zwei Arten von Gefäßverkalkungen wurden bei Erwachsenen berichtet Infiltration in die Gefäßwand. ^5,6 Medial Wand Verkalkung erfolgt unabhängig von Intima Verkalkung, lokalisiert zu Elastinfasern oder glatte Muskelzellen, und ist nicht mit Lipidablagerung oder Makrophagen – Infiltration verbunden. ^5,7,8 Untersuchungen über die molekularen Mechanismen derGefäßverkalkung haben auf zellbasierten und Tiermodellsysteme verlassen. Nagermodelle für atherocalcific Krankheit gehören Mäuse einen Mangel an entweder Apolipoprotein E (ApoE) ^9,10 oder Low-Density – Lipoprotein – Rezeptor (LDLR) ¹¹ zugeführt , eine fettreiche Diät, während Modelle für mediale Verkalkung gehören Mäuse mit Matrix – Gla – Protein (MGP) -Mangel ¹² oder Ratten , die Urämie entweder in der Nähe von insgesamt Nephrektomie (die 5/6. Nephrektomie – Modell) oder durch Bestrahlen mit einem High-Adenin – Diät zu entwickeln. ¹³

Hier wird das Modell der medialen Gefäßverkalkung im Zusammenhang mit MGP Mangel konzentriert sich auf. MGP ist ein extrazelluläres Protein , das Arterienverkalkung hemmt. ¹² Mutationen im MGP – Gens in Keutel Syndrom, eine seltene Krankheit beim Menschen gekennzeichnet durch diffuse Knorpelverkalkung neben brachytelephalangy, Hörverlust und periphere Pulmonalstenose identifiziert worden. ^14-18 Obwohl nicht oft beobachtet, ¹⁹konzentrischer Verkalkungs mehrerer Arterien wurde in Keutel Syndrom beschrieben. ²⁰ Gemeinsame Polymorphismen im menschlichen MGP – Gens sind mit einem erhöhten Risiko für koronare Arterienverkalkung zugeordnet, ^21-23 während höhere Blutspiegel von nicht – carboxyliertem, biologisch inaktive MGP kardiovaskuläre Mortalität vorherzusagen. ²⁴ Im Gegensatz zum Menschen mit Keutel Syndrom, MGP-defiziente Mäuse eine schwere vaskuläre Phänotyp bei zwei Wochen alte spontan weit verbreitet , bestehend aus Startarterienverkalkung entwickeln und 6-8 Wochen nach der Geburt aufgrund Aortenruptur sterben. ¹²

Im Gegensatz zu ApoE ^{– / –} und LDLR ^{– / –} Mäuse gefüttert eine fettreiche Diät, die mit zugehörigen Makrophagen-induzierte Entzündung der Intima Gefäßverkalkung entwickeln, MGP ^{– / -.} Mäuse in Abwesenheit von Makrophagen – Infiltration medial Gefäßverkalkung entwickeln ^11,25 Obwohl diese Ergebnisse legen nahe, verschiedene zugrunde liegende Reize für intimal und mediale Verkalkung ist es eine Überlappung in den Signalisierungsmechanismen , die beide Formen der Verkalkung vermitteln. ²⁶ Multiple Signalwege identifiziert wurden, die zu Gefäßverkalkung einschließlich entzündlicher Mediatoren, wie Tumornekrosefaktor-α und IL-1 und pro-osteogenen Faktoren tragen Diese signal~~POS=TRUNC erhöhen die Expression der Transkriptionsfaktoren , wie beispielsweise Notch, Wnt und bone morphogenetic protein (BMP) signalisiert. ^27,28 runt bezogenen Transkriptionsfaktor 2 (Runx2) und osterix, die wiederum die Expression von Knochen-verwandte Proteine ​​erhöhen ( . zB Osteocalcin, Sclerostin und alkalische Phosphatase) in den Gefäßen , die Verkalkung vermitteln ^28-30 Wir und andere haben gezeigt , dass die Gefäßverkalkung in ApoE beobachtet ^{– / –} und LDLR ^{– / –} Mäuse eine fettreiche Ernährung und die spontane gefüttert Gefäß beobachtet Verkalkung in MGP ^{– / –} Mäuse hängen alle von Knochen – morphogenetischen Protein (BMP) signaling, und es ist dieser Weg, der hier konzentriert. ^11,25,31 BMPs sind potente osteogenen Faktoren für die Knochenbildung erforderlich ist, und sind dafür bekannt , eine erhöhte Expression in humanen Atherosklerose zu zeigen. ^32-34 In vitro Studien haben impliziert BMP – Signalgebung bei der Regulierung die Expression von osteogenen Faktoren wie Runx2. ^35-37 Überexpression des BMP – Liganden, BMP-2, beschleunigt die Entwicklung von Gefäßverkalkung in ApoE-defiziente Mäuse eine fettreiche Diät gefüttert. ³⁸ darüber hinaus die Verwendung von spezifischen BMP – signal~~POS=TRUNC Inhibitoren, als LDN-193189 (LDN) ^39,40 und / oder ALK3-Fc verhindert die Entwicklung von Gefäßverkalkungen in beiden LDLR ^{– / –} Mäuse eine fettreiche Ernährung und MGP-defizienten Mäusen gefüttert ^11,25.

Vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs) bei der Entwicklung von Gefäßverkalkung eine kritische Rolle spielen. ^30,41,42 der medialen Gefäßverkalkung , die in MGP-defizienten Mäusen entwickelt ist Eigenschaftedurch eine transdifferentiation von VSMCs zu einem osteogenen Phänotyp gekennzeichnet. Der Verlust der MGP führt zu einer verminderten Expression von VSMC Markern einschließlich myocardin und alpha Glattmuskelaktin, mit einer damit einhergehenden Anstieg der osteogenen Marker wie Runx2 und Osteopontin. Diese Veränderungen stimmen mit der Entwicklung von Gefäßverkalkung. ^25,43,44

Aorten – Verkalkung und Entzündung bei Mäusen typischerweise beurteilt werden für frühe Verkalkung histochemischen Techniken wie alkalische Phosphatase – Aktivität unter Verwendung von und die osteogene Aktivität, von Kossa und Alizarin – Rot – Färbung für späte Verkalkung, und immunhistochemische Protokolle , die Makrophagen – Proteinmarker Ziel (z. B. CD68, F4 / 80, Mac-1, Mac-2, Mac-3). ^9,45 jedoch erfordern diese Standard – Bildgebungstechniken Verarbeitung von Aorten Gewebe in Querschnitten, die zeitaufwendig und unvollständig aufgrund Probenahme Vorspannung und sind begrenzt in ihrer Fähigkeit, Entzündung und calcificat zu quantifizierenIons in der gesamten Aorta. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Visualisierung und ganzen Aorten und mittleren Arterienverkalkung und Makrophagen – Akkumulation quantifizieren Verwendung Nah-Infrarot – Fluoreszenz (NIR) molekulare Bildgebung ex vivo. Auch ein Verfahren zur Gewinnung und Kultivierung von primären Aorten VSMCs von Mäusen zur Verfügung gestellt ist und die Induktion der Verkalkung von murinen und humanen VSMCs in vitro , um die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen Gefäßverkalkung zu bestimmen. Diese Techniken bieten die Ermittler mit in vivo und in vitro – Methoden für atherocalcific Krankheit zu studieren.

Protocol

Alle Studien mit Mäusen wurden in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt. Gehäuse und alle Verfahren an Mäusen in dieser Studie beschrieben wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Komitees vom Massachusetts General Hospital (Unterausschuss für Forschung Animal Care) zugelassen. Alle Verfahren wurden mit Sorgfalt durchgeführt Leiden zu minimieren. 1. Vorbereitu…

Representative Results

Aortic Kalzifizierung in MGP – / – und Wildtyp – Mäusen wurde unter Verwendung von Imaging von Calcium NIR Fluoreszenz gemessen. Kein Calcium NIR – Signal wurde in den Aorten von Wildtyp – Mäusen, was das Fehlen von Verkalkungen (Abbildung 2) nachgewiesen. Ein starkes Kalzium NIR-Signal wurde in den Aorten von MGP-defizienten Mäusen nachgewiesen, die mit fortgeschrittenen Gefäßverkalkung im Einklang steht. Gewebeschnitte von Aorten von Wildtyp und MGP <su…

Discussion

Arterienverkalkung ist ein wichtiger Risikofaktor für kardiovaskuläre Erkrankungen bei Menschen und kann direkt an der Pathogenese von kardiovaskulären Ereignissen beitragen. ^1,5,52 Intimale Kalkablagerung in den dünnen faserigen Kappen von atherosklerotischen Erkrankungen vorgeschlagen lokalen biomechanischen Stress zu erhöhen und dazu beitragen, Plaque – Bruch. ^53,54 Medial Verkalkung Auswirkungen der klinischen Ergebnisse durch arterielle Steifigkeit zu erhöhen, was Herzhypertrophie induzi…

Materials

15 ml conical tube	Falcon	352096
30 G needle	BD	305106
Alpha smooth muscle actin antibody	Sigma	SAB2500963
Chamber slide	Nunc Lab-Tek	154461
Collagenase, Type 2	Worthington	LS004176
Dexamethasone	Sigma	D4902
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Life Technologies	11965-084
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, no calcium	Gibco	14190-144
Elastase	Sigma	E1250
Fetal bovine serum	Gibco	16000-044
Forceps, fine point	Roboz	RS-4972
Forceps, full curve serrated	Roboz	RS-5138
Formalin (10%)	Electron Microscopy Sciences	15740
Hank's Balanced Salt Solution	Gibco	14025-092
Human coronary artery smooth muscle cells	PromoCell	C-12511
Insulin syringe with needle	Terumo	SS30M2913
L-ascorbic acid	Sigma	A-7506
Micro-dissecting spring scissors (13mm)	Roboz	RS-5676
Micro-dissecting spring scissors (3mm)	Roboz	RS-5610
NIR, cathepsin (ProSense-750EX)	Perkin Elmer	NEV10001EX
NIR, osteogenic (OsteoSense-680EX)	Perkin Elmer	NEV10020EX
Normal Saline	Hospira	0409-4888-10
Nuclear fast red	Sigma-Aldrich	N3020
Odyssey Imaging System	Li-Cor	Odyssey 3.0
Penicillin/Streptomycin	Corning	30-001-CI
Silver nitrate (5%)	Ricca Chemical Company	6828-16
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Sigma-Aldrich	S-9390
Sodium thiosulfate	Sigma	S-1648
ß-glycerophosphate disodium salt hydrate	Sigma	G9422
Tissue culture flask, 25 cm2	Falcon	353108
Tissue culture plate (35mm x 10mm)	Falcon	353001
Tissue culture plate, six-well	Falcon	353046
Trypsin	Corning	25-053-CI
Tube rodent holder	Kent Scientific	RSTR551
Vacuum-driven filtration system	Millipore	SCGP00525