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Médecine

Calcificazione vascolare cellule muscolari lisce e imaging di aortica calcificazioni e infiammazione

Published: May 31, 2016
doi:
10.3791/54017
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1Anesthesia Center for Critical Care Research of the Department of Anesthesia, Critical Care, and Pain Medicine,Massachusetts General Hospital, 2Cardiovascular Research Center and Cardiology Division of the Department of Medicine,Massachusetts General Hospital, 3Cardiovascular Division,Brigham and Women’s Hospital, 4Harvard Medical School, 5Department of Anesthesiology,Uniklinik RWTH Aachen, RWTH Aachen University, 6Center for Immunology and Inflammatory Diseases and the Division of Rheumatology, Allergy, and Immunology of the Department of Medicine,Massachusetts General Hospital

Summary

Vascular calcification is an important predictor of and contributor to human cardiovascular disease. This protocol describes methods for inducing calcification of cultured primary vascular smooth muscle cells and for quantifying calcification and macrophage burden in animal aortas using near-infrared fluorescence imaging.

Abstract

Cardiovascular disease is the leading cause of morbidity and mortality in the world. Atherosclerotic plaques, consisting of lipid-laden macrophages and calcification, develop in the coronary arteries, aortic valve, aorta, and peripheral conduit arteries and are the hallmark of cardiovascular disease. In humans, imaging with computed tomography allows for the quantification of vascular calcification; the presence of vascular calcification is a strong predictor of future cardiovascular events. Development of novel therapies in cardiovascular disease relies critically on improving our understanding of the underlying molecular mechanisms of atherosclerosis. Advancing our knowledge of atherosclerotic mechanisms relies on murine and cell-based models. Here, a method for imaging aortic calcification and macrophage infiltration using two spectrally distinct near-infrared fluorescent imaging probes is detailed. Near-infrared fluorescent imaging allows for the ex vivo quantification of calcification and macrophage accumulation in the entire aorta and can be used to further our understanding of the mechanistic relationship between inflammation and calcification in atherosclerosis. Additionally, a method for isolating and culturing animal aortic vascular smooth muscle cells and a protocol for inducing calcification in cultured smooth muscle cells from either murine aortas or from human coronary arteries is described. This in vitro method of modeling vascular calcification can be used to identify and characterize the signaling pathways likely important for the development of vascular disease, in the hopes of discovering novel targets for therapy.

Introduction

Le malattie cardiovascolari sono la principale causa di morbilità e mortalità nel mondo, compresi gli Stati Uniti dove rappresenta oltre 780.000 morti ogni anno. 1 coronarica calcificazione delle arterie e calcificazione aortica sono le caratteristiche della malattia aterosclerotica e fungono da forti predittori di eventi cardiovascolari. 2- 4 Due tipi principali di calcificazione vascolare sono stati riportati in adulti: calcificazione intimale, associata con l'aterosclerosi, e mediale (noto anche come Mönckeberg) calcificazione, associata a malattia renale cronica e diabete 5 intimale la calcificazione si verifica nel contesto di accumulo di lipidi e macrofagi. infiltrazione nella parete del vaso. 5,6 mediale calcificazione parete si verifica indipendentemente intimale calcificazioni, localizza alle fibre di elastina o cellule muscolari lisce, e non è associato con la deposizione di lipidi o infiltrazione dei macrofagi. 5,7,8 studi sui meccanismi molecolari dicalcificazione vascolare hanno fatto affidamento su sistemi modello basati su celle e animali. Modelli di roditori per la malattia atherocalcific includono topi deficienti in entrambi apolipoproteina E (ApoE) 9,10 o recettore delle lipoproteine ​​a bassa densità (LDLR) 11 alimentati con una dieta ricca di grassi, mentre i modelli per la calcificazione mediale includono topi con deficit di matrice proteica Gla (MGP) 12 o ratti che si sviluppano uremia o da nefrectomia quasi totale (il modello nefrectomia 5/6 °) o dall'esposizione ad una dieta ricca di adenina. 13

Qui, il modello di calcificazione vascolare mediale associata a carenza di MGP è focalizzata su. MGP è una proteina extracellulare che inibisce la calcificazione delle arterie. 12 mutazioni nel gene MGP sono state identificate nella sindrome Keutel, una malattia umana rara, caratterizzata da diffuse calcificazioni cartilagine oltre a brachitelefalangia, perdita di udito, e la stenosi polmonare periferica. 14-18 Anche se non spesso osservato, 19calcificazioni concentrica di più arterie è stata descritta nella sindrome Keutel. 20 polimorfismi comuni nel gene MGP umana sono associate ad un aumentato rischio di calcificazione delle arterie coronariche, 21-23 mentre alti livelli circolanti di uncarboxylated, MGP biologicamente inattivo predicono la mortalità cardiovascolare. 24 A differenza di esseri umani con la sindrome Keutel, topi MGP-deficienti sviluppano un fenotipo vascolare grave composto da spontanea diffusa la calcificazione delle arterie a partire da due settimane di età e morire 6-8 settimane dopo la nascita a causa di rottura aortica. 12

A differenza di ApoE – / – e LDLR – / – mice nutriti con una dieta ricca di grassi, che si sviluppano calcificazione vascolare intimale con l'infiammazione dei macrofagi indotta associata, MGP – / -. Topi sviluppano calcificazione vascolare mediale in assenza di infiltrazione di macrofagi 11,25 Sebbene questi risultati suggeriscono stimoli diversi sottostanti incontri intimiAl e calcificazione mediale, non vi è sovrapposizione nei meccanismi di segnalazione che mediano entrambe le forme di calcificazione. 26 Molteplici vie di segnalazione sono stati identificati che contribuiscono alla calcificazione vascolare compreso mediatori infiammatori come fattore di necrosi tumorale-α e IL-1 e fattori pro-osteogeniche come Notch, Wnt, e la proteina morfogenetica dell'osso (BMP) di segnalazione. 27,28 Questi percorsi di segnalazione aumentare l'espressione dei fattori di trascrizione runt legati fattore di trascrizione 2 (Runx2) e Osterix, che a loro volta aumentano l'espressione di proteine ​​ossee correlate ( . ad esempio, osteocalcina, sclerostina, e fosfatasi alcalina) nel sistema vascolare che mediano la calcificazione 28-30 Noi e altri hanno dimostrato che la calcificazione vascolare osservata in ApoE – / – e LDLR – / – topi nutriti con una dieta ricca di grassi e la spontanea calcificazione vascolare osservato in MGP – / – mice tutti dipendono dalla proteina morfogenetica dell'osso (BMP) SIgnaling, ed è questo percorso che si concentra qui. 11,25,31 BMP sono potenti fattori osteogeniche necessari per la formazione delle ossa e sono noti per esporre una maggiore espressione nell'aterosclerosi umana. 32-34 Studi in vitro hanno implicato segnalazione BMP nella regolazione l'espressione di fattori osteogenici come Runx2. 35-37 sovraespressione del ligando BMP, BMP-2, accelera lo sviluppo di calcificazione vascolare in topi ApoE-carente alimentati con una dieta ad alta percentuale di grassi. 38 Inoltre, l'uso di specifici BMP segnalazione inibitori tali come LDN-193.189 (LDN) 39,40 e / o ALK3-Fc impedisce lo sviluppo di calcificazione vascolare in entrambi LDLR – / – mice nutriti con una dieta ricca di grassi e topi MGP-deficienti 11,25.

Cellule muscolari lisce vascolari (VSMC) hanno un ruolo fondamentale nello sviluppo della calcificazione vascolare. 30,41,42 La calcificazione vascolare mediale che si sviluppa in MGP-carente topo è caratterizzati da una transdifferenziazione di VSMC a un fenotipo osteogenico. Perdita di MGP risultati in diminuita espressione di marcatori VSMC tra cui myocardin e alfa actina muscolo liscio, con un concomitante aumento marcatori osteogeniche quali Runx2 e osteopontina. Questi cambiamenti coincidono con lo sviluppo di calcificazione vascolare. 25,43,44

Calcificazione aortica e l'infiammazione nei topi sono in genere valutate utilizzando tecniche istochimiche come l'attività della fosfatasi alcalina per la calcificazione precoce e l'attività osteogenica, von Kossa e alizarina colorazione rossa per la fine di calcificazione, e protocolli di immunoistochimica che colpiscono marcatori proteici macrofagi (ad es., CD68, F4 / 80, Mac-1, Mac-2, Mac-3). 9,45 Tuttavia, queste tecniche di imaging standard richiede la lavorazione di tessuti aortici in sezioni trasversali, che è lunga e imperfetta tempo a causa di errori di campionamento, e sono limitati nella loro capacità di quantificare l'infiammazione e calcificatione in tutta dell'aorta. Questo protocollo descrive un metodo per visualizzare e quantificare tutta la calcificazione delle arterie aortica e medie imprese e l'accumulo di macrofagi utilizzando fluorescenza nel vicino infrarosso (NIR) imaging molecolare ex vivo. È inoltre disponibile un metodo per la raccolta e la coltura VSMC aortici primari da topi e indurre il calcificazione dei murina e VSMC umani in vitro al fine di determinare i meccanismi molecolari alla base calcificazione vascolare. Queste tecniche prevedono l'investigatore sia in vivo e metodi in vitro per lo studio della malattia atherocalcific.

Protocol

Tutti gli studi con i topi sono stati eseguiti in stretta conformità con le raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health. Corpo e tutte le procedure che coinvolgono i topi descritti in questo studio sono stati approvati dalla cura degli animali e Istituzionale Uso comitati del Massachusetts General Hospital (sottocomitato per Animal Care Research). Tutte le procedure sono state eseguite con cura per ridurre al minimo le sofferenze. <p clas…

Representative Results

Calcificazione aortica in MGP – / – e wild-type topi è stata misurata utilizzando l'imaging di NIR calcio fluorescenza. Nessun segnale NIR calcio è stato rilevato nelle aorte di topi wild-type, che indica l'assenza di calcificazione (figura 2). Un segnale NIR calcio forte è stata rilevata nelle aorte da MGP-carente topo, che è coerente con la calcificazione vascolare avanzata. Le sezioni di tessuto di aorte da wild-type e MGP – / – mice …

Discussion

Calcificazione arteriosa è un importante fattore di rischio per le malattie cardiovascolari negli esseri umani e può contribuire direttamente alla patogenesi di eventi cardiovascolari. 1,5,52 deposizione di calcio intimale nei sottili tappi fibrose di malattia aterosclerotica è stato proposto di aumentare lo stress biomeccanico locale e contribuire alla rottura della placca. 53,54 calcificazione impatti mediale risultati clinici, aumentando la rigidità arteriosa, che può indurre l'ipertrof…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Sarnoff Cardiovascular Research Foundation (MFB and TET), the Howard Hughes Medical Institute (TM), the Ladue Memorial Fellowship Award from Harvard Medical School (DKR), the START-Program of the Faculty of Medicine at RWTH Aachen (MD), the German Research Foundation (DE 1685/1-1, MD), the National Eye Institute (R01EY022746, ESB), the Leducq Foundation (Multidisciplinary Program to Elucidate the Role of Bone Morphogenetic Protein Signaling in the Pathogenesis of Pulmonary and Systemic Vascular Diseases, PBY, KDB, and DBB), the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (R01AR057374, PBY), the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R01DK082971, KDB and DBB), the American Heart Association Fellow-to-Faculty Award #11FTF7290032 (RM), and the National Heart, Lung, and Blood Institute (R01HL114805 and R01HL109506, EA; K08HL111210, RM).

Materials

15 ml conical tube Falcon 352096
30 G needle BD 305106
Alpha smooth muscle actin antibody Sigma SAB2500963
Chamber slide Nunc Lab-Tek 154461
Collagenase, Type 2  Worthington LS004176
Dexamethasone Sigma D4902
Dulbecco's Modified Eagle Medium Life Technologies 11965-084
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, no calcium Gibco 14190-144
Elastase Sigma E1250
Fetal bovine serum Gibco 16000-044
Forceps, fine point Roboz RS-4972
Forceps, full curve serrated Roboz RS-5138
Formalin (10%) Electron Microscopy Sciences 15740
Hank's Balanced Salt Solution Gibco 14025-092
Human coronary artery smooth muscle cells PromoCell C-12511
Insulin syringe with needle Terumo SS30M2913
L-ascorbic acid Sigma A-7506
Micro-dissecting spring scissors (13mm) Roboz RS-5676
Micro-dissecting spring scissors (3mm) Roboz RS-5610
NIR, cathepsin (ProSense-750EX) Perkin Elmer NEV10001EX
NIR, osteogenic (OsteoSense-680EX) Perkin Elmer NEV10020EX
Normal Saline Hospira 0409-4888-10
Nuclear fast red Sigma-Aldrich N3020
Odyssey Imaging System Li-Cor Odyssey 3.0
Penicillin/Streptomycin Corning 30-001-CI
Silver nitrate (5%) Ricca Chemical Company 6828-16
Sodium phosphate dibasic heptahydrate Sigma-Aldrich S-9390
Sodium thiosulfate Sigma S-1648
ß-glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma G9422
Tissue culture flask, 25 cm2 Falcon 353108
Tissue culture plate (35mm x 10mm) Falcon 353001
Tissue culture plate, six-well Falcon 353046
Trypsin Corning 25-053-CI
Tube rodent holder Kent Scientific RSTR551
Vacuum-driven filtration system Millipore SCGP00525
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O’Rourke, C., Shelton, G., Hutcheson, J. D., Burke, M. F., Martyn, T., Thayer, T. E., Shakartzi, H. R., Buswell, M. D., Tainsh, R. E., Yu, B., Bagchi, A., Rhee, D. K., Wu, C., Derwall, M., Buys, E. S., Yu, P. B., Bloch, K. D., Aikawa, E., Bloch, D. B., Malhotra, R. Calcification of Vascular Smooth Muscle Cells and Imaging of Aortic Calcification and Inflammation. J. Vis. Exp. (111), e54017, doi:10.3791/54017 (2016).
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