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Médecine

대동맥 석회화와 염증의 혈관 평활근 세포 및 이미지의 석회화

Published: May 31, 2016
doi:
10.3791/54017
, , , , , , , , , , , , , , , , , , ,
1Anesthesia Center for Critical Care Research of the Department of Anesthesia, Critical Care, and Pain Medicine,Massachusetts General Hospital, 2Cardiovascular Research Center and Cardiology Division of the Department of Medicine,Massachusetts General Hospital, 3Cardiovascular Division,Brigham and Women’s Hospital, 4Harvard Medical School, 5Department of Anesthesiology,Uniklinik RWTH Aachen, RWTH Aachen University, 6Center for Immunology and Inflammatory Diseases and the Division of Rheumatology, Allergy, and Immunology of the Department of Medicine,Massachusetts General Hospital

Summary

Vascular calcification is an important predictor of and contributor to human cardiovascular disease. This protocol describes methods for inducing calcification of cultured primary vascular smooth muscle cells and for quantifying calcification and macrophage burden in animal aortas using near-infrared fluorescence imaging.

Abstract

Cardiovascular disease is the leading cause of morbidity and mortality in the world. Atherosclerotic plaques, consisting of lipid-laden macrophages and calcification, develop in the coronary arteries, aortic valve, aorta, and peripheral conduit arteries and are the hallmark of cardiovascular disease. In humans, imaging with computed tomography allows for the quantification of vascular calcification; the presence of vascular calcification is a strong predictor of future cardiovascular events. Development of novel therapies in cardiovascular disease relies critically on improving our understanding of the underlying molecular mechanisms of atherosclerosis. Advancing our knowledge of atherosclerotic mechanisms relies on murine and cell-based models. Here, a method for imaging aortic calcification and macrophage infiltration using two spectrally distinct near-infrared fluorescent imaging probes is detailed. Near-infrared fluorescent imaging allows for the ex vivo quantification of calcification and macrophage accumulation in the entire aorta and can be used to further our understanding of the mechanistic relationship between inflammation and calcification in atherosclerosis. Additionally, a method for isolating and culturing animal aortic vascular smooth muscle cells and a protocol for inducing calcification in cultured smooth muscle cells from either murine aortas or from human coronary arteries is described. This in vitro method of modeling vascular calcification can be used to identify and characterize the signaling pathways likely important for the development of vascular disease, in the hopes of discovering novel targets for therapy.

Introduction

그것은 매년 780,000 이상의 사망자를 차지하고 경우 심혈관 질환은 미국을 포함한 세계의 이환율과 사망률의 주요 원인입니다. 1 관상 동맥 석회화 및 대동맥 석회화는 동맥 경화성 질환의 특징이며, 심혈관 질환의 강한 예측을 제공합니다. 2 내막 석회화 경화증과 연관 내측 만성 신장 질환, 당뇨병과 연관된 석회화 (또한 Mönckeberg라고도 함) 5 내막 석회화 지질 축적과 마크로파지의 설정에서 발생 혈관 석회화 4 2 가지 주요 유형은 성인에서보고되었다. 혈관 벽에 침투. 5,6 내측 벽 석회화는 독립적 내막 석회화가 발생 엘라스틴 섬유 또는 평활근 세포에 지역화 및 지질 증착 또는 대 식세포의 침윤과 연결되어 있지 않습니다. 5,7,8 연구를의 분자 메커니즘에혈관 석회화는 셀 기반 및 동물 모델 시스템에 의존하고있다. 중간 석회화에 대한 모델 매트릭스 GLA 단백질과 쥐를 포함하는 동안 atherocalcific 질환의 설치류 모델, 아포 지단백 E (아포 E) 9, 10 또는 저밀도 지단백 수용체 (LDLR) (11)는 고지방식이를 공급하거나 결핍 된 쥐를 포함 (MGP) 결핍 (12) 또는 가까운 총 신장 절제술 (5 / 6의 신장 절제술 모델) 또는 높은 아데닌 다이어트에 노출하거나 요독증을 개발 쥐. (13)

여기에, MGP 결핍과 관련된 중간 혈관 석회화의 모델에 초점을 맞추고 있습니다. MGP 동맥 석회화 억제 세포 외 단백질이다. MGP 유전자 12 돌연변이 Keutel 증후군 brachytelephalangy 외에 확산 연골 석회화 특징으로하는 드문 인간 질병, 청각 상실, 말초 폐 협착증에서 확인되었다. 14-18 아니지만 자주 관찰 (19)여러 동맥의 동심 석회화가. Keutel 증후군에 설명 된 uncarboxylated, 생물학적 비활성 MGP의 높은 순환 수준이 심혈관 사망률을 예측하는 동안 인간의 MGP 유전자의 20 일반 다형성은 관상 동맥 석회화 위험이 증가, 21 ~ 23과 연관된다. (24) 인간과는 달리 Keutel 증후군, MGP 결핍 된 마우스는 나이 2 주에서 시작 인해 대동맥 파열로 출생 후 6-8주 다이 자연 광범위한 동맥 석회화로 구성된 심한 혈관 표현형을 개발한다. (12)

아포 달리 – / – 및 LDLR – / – 마우스에 고지방식이를 공급, 연관된 대 식세포 유도 염증 내막의 혈관 석회화를 개발하는 MGP – / -. 생쥐 대 식세포 침윤의 부재에서 내측 혈관 석회화 개발 11,25 비록 이러한 연구 결과는 intim에 대해 서로 다른 기본 자극을 제안Al 및 내측 석회화, 예컨대 종양 괴사 인자 α 및 IL-1과 프로 골 형성 인자 같은 염증성 매개체를 포함한 혈관 석회화 기여 확인되었다 석회화. 26 다중 신호 전달 경로의 두 형태를 매개 시그널링 메커니즘 오버랩 존재 이러한 노치의 Wnt, 골 형태 형성 단백질 (BMP) 신호. 27,28 이러한 신호 전달 경로는 다시 뼈 관련 단백질의 발현을 증가 전사 인자 런트 관련 전사 인자 2 (Runx2)과 osterix의 발현 (증가 . – / – 및 LDLR – / – 마우스에 고지방 및 자발 먹이 예 석회화를 매개 맥관 구조에서, 오스테오칼신, sclerostin, 알칼리 포스파타제) 28-30 우리 등은 아포 관찰 혈관 석회화가 입증 – / – MGP에서 관찰되는 혈관 석회화 모든 뼈 형태 형성 단백질에 따라 마우스 (BMP)시gnaling하고, 여기에 초점이 경로이다. 11,25,31 BMPs에 뼈 형성을 위해 요구되는 강력한 골 형성 인자이다 인간 동맥 경화증의 발현 증가를 나타내는 것으로 알려져있다. 32-34 시험 관내 연구는 조절하는 BMP 시그널링을 연루 이러한 Runx2 같은 골 형성 인자의 발현. BMP 리간드 35-37 과발현, BMP-2, 고지방식이 공급 아포 E 결손 마우스에서 혈관 석회화의 개발을 가속화. (38) 또한, 이러한 억제제 시그널링 특정 BMP의 사용 – / – (39, 40) 및 / 또는 LDN-193189 (LDN)로 ALK3-FC 모두 LDLR 혈관 석회화 현상을 방지 마우스에 고지방 및 MGP 결핍 생쥐 먹이 11,25.

혈관 평활근 세포 (혈관 평활근 세포)가 혈관 석회화의 개발에 중요한 역할을한다. 30,41,42에서 개발 내측 혈관 석회화 MGP를 결핍 된 마우스는 charac입니다골아 세포 표현형에 혈관 평활근 세포의 분화에 의해 terized. 이러한 Runx2 및 오스테 오 폰틴 등의 골 형성 마커의 동반 상승 myocardin과 알파 평활근 액틴을 포함하여 혈관 평활근 세포 마커의 감소 식 MGP 결과의 손실. 이러한 변화는 혈관 석회화의 개발과 일치한다. 25,43,44

대동맥 석회화와 마우스에 염증이 일반적으로 말 석회화 조기 석회화 및 골 형성 활동, 폰 코사와 알리자린 레드 염색에 대한 알칼리 포스 파타 아제 활성 및 대식 세포 단백질 마커 (예. 대상으로 면역 조직 화학 프로토콜과 같은 조직 화학적 기술을 이용하여 평가된다, CD68, F4 / 80 맥 1 맥이 맥-3). 9,45 그러나,이 기준 영상 기술 의한 샘플링 바이어스 소모적이고 불완전한 시간 단면으로 대동맥 조직의 처리를 필요로하고 제한된 그들의 염증과 calcificat을 정량화 할 수있는 능력전체 대동맥에 이온. 이 프로토콜은 또한 제공. 시각화 전체 대동맥 및 중간 크기 동맥 석회화 근적외선 형광 (NIR) 분자 이미징 생체를 이용하여 대 식세포 축적을 정량하는 방법을 설명 수확 및 마우스로부터 주 대동맥 혈관 평활근 세포를 배양하여 유도하는 방법 위해 쥐와 시험관에서 인간의 혈관 평활근 세포의 석회화는 혈관의 석회화를 기본 분자 메커니즘을 확인합니다. 이러한 기술은 생체 내에서와 atherocalcific 질병 연구를위한 체외 방법에서 모두 연구자를 제공합니다.

Protocol

마우스 모든 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드의 권장 사항을 엄격히 준수 하였다. 주택과 본 연구에서 설명 된 쥐를 포함하는 모든 절차 (연구 동물 관리에 분과위원회)가 기관 동물 케어 및 사용위원회 매사추세츠 종합 병원의 승인 하였다. 모든 절차는 고통을 최소화하기 위해 신중하게 수행 하였다. 시약 1. 준비 <…

Representative Results

– / – 대동맥 MGP 석회화와 야생형 마우스 칼슘 NIR 형광 이미징을 사용하여 측정 하였다. 어떤 칼슘 NIR 신호 석회화 부재 (도 2)를 나타내는 야생형 마우스의 대동맥에서 검출되지 않았다. 강한 칼슘 NIR 신호는 향상된 혈관 석회화와 일치 MGP 결핍 마우스의 대동맥에서 검출되었다. 야생형로부터 대동맥의 조직 절편 MGP – / – 야생형 마우스 검출없?…

Discussion

동맥 석회화는 인간에서 심장 질환의 중요한 위험 인자 및 심혈관 질환의 발병에 직접적으로 기여할 수있다. 죽상 동맥 경화 질환의 얇은 섬유 대문자 1,5,52 내막 칼슘 증착 지역 역학적 스트레스 증가에 기여하는 것이 제안되어왔다 플라크 파열. 심장 비대를 유발하고 심장 기능에 영향을 미칠 수있는 동맥 경화를 증가시켜 53, 54 내측 석회화에 미치는 영향 임상 결과를. (55)</s…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Sarnoff Cardiovascular Research Foundation (MFB and TET), the Howard Hughes Medical Institute (TM), the Ladue Memorial Fellowship Award from Harvard Medical School (DKR), the START-Program of the Faculty of Medicine at RWTH Aachen (MD), the German Research Foundation (DE 1685/1-1, MD), the National Eye Institute (R01EY022746, ESB), the Leducq Foundation (Multidisciplinary Program to Elucidate the Role of Bone Morphogenetic Protein Signaling in the Pathogenesis of Pulmonary and Systemic Vascular Diseases, PBY, KDB, and DBB), the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (R01AR057374, PBY), the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R01DK082971, KDB and DBB), the American Heart Association Fellow-to-Faculty Award #11FTF7290032 (RM), and the National Heart, Lung, and Blood Institute (R01HL114805 and R01HL109506, EA; K08HL111210, RM).

Materials

15 ml conical tube Falcon 352096
30 G needle BD 305106
Alpha smooth muscle actin antibody Sigma SAB2500963
Chamber slide Nunc Lab-Tek 154461
Collagenase, Type 2  Worthington LS004176
Dexamethasone Sigma D4902
Dulbecco's Modified Eagle Medium Life Technologies 11965-084
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, no calcium Gibco 14190-144
Elastase Sigma E1250
Fetal bovine serum Gibco 16000-044
Forceps, fine point Roboz RS-4972
Forceps, full curve serrated Roboz RS-5138
Formalin (10%) Electron Microscopy Sciences 15740
Hank's Balanced Salt Solution Gibco 14025-092
Human coronary artery smooth muscle cells PromoCell C-12511
Insulin syringe with needle Terumo SS30M2913
L-ascorbic acid Sigma A-7506
Micro-dissecting spring scissors (13mm) Roboz RS-5676
Micro-dissecting spring scissors (3mm) Roboz RS-5610
NIR, cathepsin (ProSense-750EX) Perkin Elmer NEV10001EX
NIR, osteogenic (OsteoSense-680EX) Perkin Elmer NEV10020EX
Normal Saline Hospira 0409-4888-10
Nuclear fast red Sigma-Aldrich N3020
Odyssey Imaging System Li-Cor Odyssey 3.0
Penicillin/Streptomycin Corning 30-001-CI
Silver nitrate (5%) Ricca Chemical Company 6828-16
Sodium phosphate dibasic heptahydrate Sigma-Aldrich S-9390
Sodium thiosulfate Sigma S-1648
ß-glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma G9422
Tissue culture flask, 25 cm2 Falcon 353108
Tissue culture plate (35mm x 10mm) Falcon 353001
Tissue culture plate, six-well Falcon 353046
Trypsin Corning 25-053-CI
Tube rodent holder Kent Scientific RSTR551
Vacuum-driven filtration system Millipore SCGP00525
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O’Rourke, C., Shelton, G., Hutcheson, J. D., Burke, M. F., Martyn, T., Thayer, T. E., Shakartzi, H. R., Buswell, M. D., Tainsh, R. E., Yu, B., Bagchi, A., Rhee, D. K., Wu, C., Derwall, M., Buys, E. S., Yu, P. B., Bloch, K. D., Aikawa, E., Bloch, D. B., Malhotra, R. Calcification of Vascular Smooth Muscle Cells and Imaging of Aortic Calcification and Inflammation. J. Vis. Exp. (111), e54017, doi:10.3791/54017 (2016).
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