Vascular calcification is an important predictor of and contributor to human cardiovascular disease. This protocol describes methods for inducing calcification of cultured primary vascular smooth muscle cells and for quantifying calcification and macrophage burden in animal aortas using near-infrared fluorescence imaging.
Cardiovascular disease is the leading cause of morbidity and mortality in the world. Atherosclerotic plaques, consisting of lipid-laden macrophages and calcification, develop in the coronary arteries, aortic valve, aorta, and peripheral conduit arteries and are the hallmark of cardiovascular disease. In humans, imaging with computed tomography allows for the quantification of vascular calcification; the presence of vascular calcification is a strong predictor of future cardiovascular events. Development of novel therapies in cardiovascular disease relies critically on improving our understanding of the underlying molecular mechanisms of atherosclerosis. Advancing our knowledge of atherosclerotic mechanisms relies on murine and cell-based models. Here, a method for imaging aortic calcification and macrophage infiltration using two spectrally distinct near-infrared fluorescent imaging probes is detailed. Near-infrared fluorescent imaging allows for the ex vivo quantification of calcification and macrophage accumulation in the entire aorta and can be used to further our understanding of the mechanistic relationship between inflammation and calcification in atherosclerosis. Additionally, a method for isolating and culturing animal aortic vascular smooth muscle cells and a protocol for inducing calcification in cultured smooth muscle cells from either murine aortas or from human coronary arteries is described. This in vitro method of modeling vascular calcification can be used to identify and characterize the signaling pathways likely important for the development of vascular disease, in the hopes of discovering novel targets for therapy.
O yılda 780.000 üzerinde ölüm hesapları nerede kardiyovasküler hastalık Amerika Birleşik Devletleri'nde olmak üzere dünyada morbidite ve mortalitenin önde gelen nedeni vardır. 1 Koroner arter kalsifikasyonu ve aort kalsifikasyon aterosklerotik hastalığın özellikleridir ve kardiyovasküler olayların güçlü belirleyicileri olarak hizmet vermektedir. 2- intimal kalsifikasyon ateroskleroza bağlı ve orta kronik böbrek hastalığı ve diyabet ile bağlantılı kalsifikasyon, (aynı zamanda, Mönckeberg olarak da bilinir) 5 intimal kalsifikasyon lipid birikimi ve makrofaj ortamda oluşur: vasküler kalsifikasyon 4 İki ana tip yetişkin bildirilmiştir. damar duvarı içine sızma. 5,6 Medial duvar kalsifikasyon, bağımsız intimal kalsifikasyon meydana elastin lifleri veya düz kas hücrelerinde lokalize ve lipid birikimi veya makrofaj infiltrasyonu ile ilişkili değildir. 5,7,8 Çalışmaları moleküler mekanizmaları üzerindeVasküler kalsifikasyon hücre bazlı ve hayvan modeli sistemlerinde yararlanmıştır. Medial kalsifikasyon için modeller matriks Gla proteini ile fareler dahil ederken atherocalcific hastalık için kemirgen modelleri, apolipoprotein E (Apo) 9,10 veya düşük yoğunluklu lipoprotein reseptörü (LDLR) 11 yüksek yağlı diyetle beslenen ya eksik fareler dahil (MGP) eksikliği 12 veya yakınındaki total nefrektomi (5/6 nefrektomi modeli) ya da yüksek adenin diyet maruz ya üremi geliştirmek sıçanlar. 13
Burada, MGP eksikliği ile ilişkili vasküler kalsifikasyon modeli odaklanmıştır. MGP arteriyel kalsifikasyon inhibe eden bir hücre dışı bir proteindir. MGP geninde 12 mutasyon Keutel sendromu, brachytelephalangy ek olarak yaygın kıkırdak kalsifikasyon ile karakterize nadir insan hastalığı, işitme kaybı ve periferik pulmoner stenoz tespit edilmiştir. 14-18 olmasa da sık sık gözlenen, 19çoklu arter eş kireçlenme. Keutel sendromu tarif edilmiştir uncarboxylated, biyolojik olarak aktif olmayan mgp yüksek dolaşım düzeyleri kardiyovasküler mortalite tahmin ederken, insan MGP geninde 20 ortak polimorfizmler, koroner arter kalsifikasyon riski, 21-23 ile ilişkilidir. 24. İnsanlarda aksine Keutel sendromlu, MGP eksikliği fareler iki hafta başlayan ve aort rüptürü doğumdan sonra 6-8 hafta die spontan yaygın arteriyel kalsifikasyon oluşan ciddi vasküler fenotip gelişir. 12
ApoE aksine – / – ve LDLR – / – fareler yüksek yağlı diyetle beslenen, ilişkili makrofaj kaynaklı inflamasyon ile intimal vasküler kalsifikasyon geliştirmek, hangi MGP – / -. Fareler makrofajların yokluğunda medial vasküler kalsifikasyon geliştirmek 11,25 rağmen bu bulgular Sex Amaçlı altta yatan farklı uyaranlara önermekal ve medial kalsifikasyon, tümör nekroz faktörü-a ve IL-1 ve ön-osteojenik faktör gibi inflamatuar aracıları içeren vasküler kalsifikasyon katkı tespit edilmiştir kireçlenme. 26 Çoklu sinyal yollarının her iki yapı da aracılık sinyal mekanizmalarında örtüşme vardır Bu çentik Wnt ve kemik morfojenik protein (BMP) sinyal. 27,28 Bunlar sinyal yolları da kemik ilişkili proteinlerin ifadesini artırmak transkripsiyon faktörlerinin solucan ile ilgili transkripsiyon faktörü 2 (Runx2) ve Osterix ekspresyonunu (geliştirmek . / – – ve LDLR – / – fareleri, yüksek yağlı diyet ve kendiliğinden beslenen örneğin kalsifikasyon aracılık damar sisteminde, kemik sklerostin ve alkalin fosfataz) 28-30 Biz ve diğerleri ApoE gözlemlenen vasküler kalsifikasyon göstermiştir / – – MGP gözlenen vasküler kalsifikasyon tüm kemik morfogenetik protein bağlıdır farelerin (BMP) signaling ve burada odaklanmıştır, bu yoldur. 11,25,31 BMP kemik oluşumu için gerekli olan güçlü bir osteojenik faktör, insan ateroskleroz içinde arttırılmış ekspresyon sergileyen bilinmektedir. 32-34 in vitro çalışmalar, düzenlenmesinde BMP sinyal rol var bu Runx2 olarak osteojenik faktör sentezlenmesi. BMP ligandının 35-37 aşırı ekspresyonu, BMP-2, yüksek yağlı diyet ile beslenen ApoE eksikliği olan farelerde vasküler kalsifikasyon gelişimini hızlandırır. 38 Ayrıca, bu tür inhibitörleri sinyal belirli bir BMP kullanımını / – – 39,40 ve / veya LDN-193189 (LDN) olarak ALK3-Fc hem LDLR vasküler kalsifikasyon gelişimini engeller fareler yüksek yağlı diyet ve MGP eksikliği fareler beslenen 11,25.
Vasküler düz kas hücreleri (VSMC'Ier) vasküler kalsifikasyon gelişiminde önemli bir role sahiptir. 30,41,42 gelişen vasküler kalsifikasyon MGP yoksun fareler karakteristik olanbir osteojenik fenotipi VSMC'Ierin bir transdiferansiyonun tarafından terized. Böyle Runx2 ve osteopontin olarak osteojenik belirteçleri eşlik eden bir artış ile myocardin ve alfa düz kas aktin içeren VSMC belirteçlerin azalmış ifadesi MGP sonuçlarının kaybı. Bu değişiklikler vasküler kalsifikasyon gelişimi ile örtüşmektedir. 25,43,44
Aort kalsifikasyon ve farelerde iltihap tipik olarak geç kireçlenme erken kireçlenme ve osteojenik aktivite, von Kossa ve Alizarin kırmızı boyama için alkalin fosfataz aktivitesi ve makrofaj protein belirteçlerinin (örn. Hedef immünohistokimyasal protokoller olarak histokimyasal teknikler kullanılarak değerlendirilir, CD68, F4 / 80, Mac-1, Mac-2, Mac-3). 9,45 Bununla birlikte, bu, standart görüntüleme teknikleri, örnekleme yanlılığa alıcı ve kusurlu zaman enine bölüme aort dokularının işlenmesini gerektirir ve sınırlıdır kendi inflamasyon ve calcificat sayısal yeteneğiBütün aort iyon. Bu protokol, aynı zamanda sağlanan. Görselleştirmek ve bütün aort ve orta ölçekli arteryel kalsiyum ve yakın kızılötesi floresan (NIR) moleküler görüntüleme ex vivo olarak kullanılarak makrofaj birikimini ölçmek için bir yöntem tarif hasat ve farelerden primer aort VSMC'Ierin kültürlenmesi ve uyarılması için bir yöntemdir için sıçangil ve in vitro olarak insan VSMC'Ierinin kalsifikasyon vasküler kalsifikasyon altında yatan moleküler mekanizmaların belirlenmesi. Bu teknikler, in vivo ve atherocalcific hastalığı eğitimi için in vitro yöntemleri hem araştırmacı sağlar.
Arter kalsifikasyon insanlarda kardiyovasküler hastalık için önemli bir risk faktörüdür ve kardiyovasküler olayların patogenezinde doğrudan katkıda bulunabilir. Aterosklerotik hastalığın ince fibröz kapaklar 1,5,52 intimal kalsiyum birikimi yerel biyomekanik stresi arttıran ve katkıda bulunmak için öne sürülmüştür plak rüptürü. kardiyak hipertrofi neden ve kalp fonksiyonunu etkileyebilir arteriyel sertlik, artırarak 53,54 medial kalsifikasyon etkileri klinik sonuçları….
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Sarnoff Cardiovascular Research Foundation (MFB and TET), the Howard Hughes Medical Institute (TM), the Ladue Memorial Fellowship Award from Harvard Medical School (DKR), the START-Program of the Faculty of Medicine at RWTH Aachen (MD), the German Research Foundation (DE 1685/1-1, MD), the National Eye Institute (R01EY022746, ESB), the Leducq Foundation (Multidisciplinary Program to Elucidate the Role of Bone Morphogenetic Protein Signaling in the Pathogenesis of Pulmonary and Systemic Vascular Diseases, PBY, KDB, and DBB), the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (R01AR057374, PBY), the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R01DK082971, KDB and DBB), the American Heart Association Fellow-to-Faculty Award #11FTF7290032 (RM), and the National Heart, Lung, and Blood Institute (R01HL114805 and R01HL109506, EA; K08HL111210, RM).
15 ml conical tube | Falcon | 352096 | |
30 G needle | BD | 305106 | |
Alpha smooth muscle actin antibody | Sigma | SAB2500963 | |
Chamber slide | Nunc Lab-Tek | 154461 | |
Collagenase, Type 2 | Worthington | LS004176 | |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-084 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, no calcium | Gibco | 14190-144 | |
Elastase | Sigma | E1250 | |
Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
Forceps, fine point | Roboz | RS-4972 | |
Forceps, full curve serrated | Roboz | RS-5138 | |
Formalin (10%) | Electron Microscopy Sciences | 15740 | |
Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14025-092 | |
Human coronary artery smooth muscle cells | PromoCell | C-12511 | |
Insulin syringe with needle | Terumo | SS30M2913 | |
L-ascorbic acid | Sigma | A-7506 | |
Micro-dissecting spring scissors (13mm) | Roboz | RS-5676 | |
Micro-dissecting spring scissors (3mm) | Roboz | RS-5610 | |
NIR, cathepsin (ProSense-750EX) | Perkin Elmer | NEV10001EX | |
NIR, osteogenic (OsteoSense-680EX) | Perkin Elmer | NEV10020EX | |
Normal Saline | Hospira | 0409-4888-10 | |
Nuclear fast red | Sigma-Aldrich | N3020 | |
Odyssey Imaging System | Li-Cor | Odyssey 3.0 | |
Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-001-CI | |
Silver nitrate (5%) | Ricca Chemical Company | 6828-16 | |
Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | S-9390 | |
Sodium thiosulfate | Sigma | S-1648 | |
ß-glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma | G9422 | |
Tissue culture flask, 25 cm2 | Falcon | 353108 | |
Tissue culture plate (35mm x 10mm) | Falcon | 353001 | |
Tissue culture plate, six-well | Falcon | 353046 | |
Trypsin | Corning | 25-053-CI | |
Tube rodent holder | Kent Scientific | RSTR551 | |
Vacuum-driven filtration system | Millipore | SCGP00525 |