L&#39;isolement et le profilage des exosomes de Bile humain contenant microARN-

Ling Li; Klaus B. Piontek; Vivek Kumbhari; Masaharu Ishida; Florin M. Selaru

doi:10.3791/54036

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Article de méthode

L'isolement et le profilage des exosomes de Bile humain contenant microARN-

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DOI :

10.3791/54036

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13 juin 2016

Ling Li¹ , Klaus B. Piontek¹ , Vivek Kumbhari¹ , Masaharu Ishida² , Florin M. Selaru¹

¹Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine, ²Department of Surgery, Tohoku University

Dans cet article

Résumé

Le liquide biliaire est une source précieuse de vésicules/exosomes extracellulaires qui contiennent des biomarqueurs potentiellement importants. Ce protocole représente une méthode robuste pour isoler les exosomes de la bile humaine en vue d’analyses plus approfondies, y compris le profilage des miARN.

Résumé

la recherche de Exosome au cours des trois dernières années, a considérablement étendu le champ vers l'identification et la caractérisation de biomarqueurs et de leurs utilisations thérapeutiques.

Il a été démontré récemment exosomes pour contenir microARN (MIRS). Mirs se sont apparus comme biomarqueurs de valeur à des fins de diagnostic. Comme le prélèvement d'échantillons dans les cliniques et les hôpitaux est très variable, miRNA l'isolement de la bile toute varie considérablement. Pour obtenir des profils de miARN robustes, précis et reproductibles à partir d'échantillons de bile recueillies d'une manière simple nécessité l'élaboration d'un protocole de haute qualité pour isoler et caractériser les exosomes de la bile. Le procédé nécessite plusieurs centrifugations et une étape de filtration par une étape finale d'ultracentrifugation pour sédimenter les exosomes isolés. La microscopie électronique, Western blots, cytométrie en flux et l'analyse optique nanoparticule multi-paramètres, le cas échéant, sont des étapes cruciales de caractérisation pour valider la qualité de l'exosomes. Pour l'isolement des miARN de ces exosomes, Smasher le lysat avec un miARN synthétique non spécifique d'une espèce comme Caenorhabditis elegans, à savoir, Cel-miR-39, est important pour la normalisation de l' efficacité d'extraction d'ARN. L'isolement des exosomes à partir du liquide biliaire suivant cette méthode permet au succès miRNA profilage à partir d'échantillons de bile stockées pendant plusieurs années à -80 ° C.

Introduction

Comme d' autres fluides biologiques, à savoir, le lait maternel, le plasma ou l' urine, la bile contient exosomes, lipides riches vésicules ^1-4. Les exosomes peuvent induire ou altérer les fonctions biologiques dans les cellules réceptrices ^{5, 6,} une forme de communication entre les cellules qui pourraient faire partie de leur fonction normale ^{4, 7-9.} Les exosomes peuvent contenir des espèces miRNA qui peuvent fournir une source précieuse de biomarqueurs pour le diagnostic ^10. les profils miARN ont gagné une attention considérable ces dernières années en tant que marqueurs diagnostiques et pronosti....