Metastasis plays a profound role in the virulence of cancer, accounting for an estimated 90% of deaths. We report a protocol for a metastatic melanoma model in mice that is useful for determining the efficacy of therapeutic agents against this clinical phenomenon.
Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis. Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or prevention are lacking. We report a method for the establishment of pulmonary metastases in mice, useful for the study of this phenomenon. Tail vein injection of B57BL/6J mice with B16-BL6 is among the most used models for melanoma metastases. Some of the circulating tumor cells establish themselves in the lungs of the mouse, creating “experimental” metastatic foci. With this model it is possible to measure the relative effects of therapeutic agents on the development of cancer metastasis. The difference in enumerated lung foci between treated and untreated mice indicates the efficacy of metastases neutralization. However, prior to the investigation of a therapeutic agent, it is necessary to determine an optimal number of injected B16-BL6 cells for the quantitative analysis of metastatic foci. Injection of too many cells may result in an overabundance of metastatic foci, impairing proper quantification and overwhelming the effects of anti-cancer therapies, while injection of too few cells will hinder the comparison between treated and controls.
Metastase er en væsentlig dødsårsag blandt patienter med maligne sygdomme. Processen med metastatisk spredning af cancerceller er dårligt forstået, men synes at involvere adskillige trin, herunder invasion af tilstødende væv, intravasation ind lymfekarrene og kar, overlevelse og translokation inden kredsløbssygdomme, ekstravasation fra vaskulaturen ved stedet for metastase, tilpasning til den nye mikromiljø af det nye site, og kolonisering på det nye site ved proliferation og dannelse af sekundære tumorer. 1. Hver af disse biologiske begivenheder indebærer transformation, udbredelse og overlevelse af metastatiske tumorceller. For eksempel omdannelsen af epitel fænotype af tumorcellen i en mesenchymal fænotype, kombineret med den succesfulde interaktion med den ekstracellulære matrix, således at de kan invadere tilstødende væv og metastasere til andre dele af kroppen. 2,3 Endvidere er disse metastatisk cellerskal overleve i den cirkulerende blodbanen og omgå immunovervågning fra værten. 4,5 Endelig, når implanteret på et fjernt sted inden i legemet, skal tumorcellerne tilpasse sig mikromiljø for at proliferere og danne sekundære tumorer. 6,7 Derfor , selv om metastaser er et almindeligt fænomen blandt kræftpatienter, metastatiske tumorceller har flere områder af sårbarhed, der er modtagelige for terapeutisk intervention.
I betragtning af den immunogene karakter melanom, og den nylige interesse inden for immunterapi, modeller for melanoma er i stigende grad nyttige. 8 I USA alene, melanom er årsag til en anslået 9.000 dødsfald om året. 9 Almindelige placeringer af melanom-metastase er knogler, hjerne , lever og lunger. Størstedelen af metastaser til fjerne steder forekommer gennem blodbanen. Cirkulerende tumorceller i blodet skal undvige immune clearance, når en kapillær seng af en distal orgel oginvadere gennem endotelcellerne af blodkarret for at kunne etablere sig. 4-7,10, 11
For at efterligne de fælles og virulente fænomener metastase, blev det murine B16-BL6 cellelinje oprettet. En afdøde af den parentale C57BL / 6 melanomacellelinie B16-F0, B16-BL6 er slutproduktet af 10 på hinanden følgende udvælgelser til lunge metastase fra intravenøs injektion (hvilket resulterer i B16-F10), efterfulgt af 6 på hinanden følgende udvælgelser til penetration blære membran. 12 Som sådan er det en pålidelig melanom cellelinie til etablering af metastatiske foci i musen, især når det injiceres intravenøst. 13
Efter injektion af en tilstrækkelig mængde af B16-BL6-celler i halevenen af en B57BL / 6 mus, efterfulgt af to eller flere uger for at tillade implantation og vækst af B16 / BL6-celler, vil metastatiske foci dannes i lungerne. Ved eutanasi og eftersyn dissekering mikroskopi, at antallet afindividuelle foci nuværende kan kvantificeres. Dette vil igen, kan anvendes til at etablere en dosis-metastase virkning, som antallet af injicerede B16-BL6-celler korrelerer med antallet af foci dannet på overfladen af lungerne. Denne model er kendt som "eksperimentel metastase", hvor kendte-metastatisk celler indføres direkte i blodbanen, hvilket letter en hurtig og forudsigelig spredning og etablering i lunger, lever eller andre organer af undersøgelsen. Dette er i modsætning til "spontan metastase", hvor tumorceller implanteres, ofte subkutant, og metastaser stammer fra økologisk kaste kræftceller. 14,15
Det er vigtigt at injicere en passende mængde B16 / BL6-celler i halevener musene. For mange, og lungerne vil blive dækket med metastaser og tilstødende foci vil kunne skelnes fra hinanden. For få, og indflydelsen af et terapeutisk middel vil være umærkelig på grund af iboende varitioner mellem injektioner. For at opnå et optimalt antal foci på lungerne af de C57BL / 6-mus, er det nødvendigt at korrelere antallet af injicerede celler med mængden af etableret metastatiske foci på overfladen af lungerne, mens der tages hensyn til distinguishability individuelle foci. Denne protokol vil demonstrere en metastatisk murin melanom model for C57BL / 6 mus.
Cirkulerende tumorceller fra en haleveneinjektion repræsentere metastaser, der unddrage steder af primær vækst og migrere gennem ruter som blodbanen eller lymfesystemet, lejlighedsvis at etablere sig i de kapillære senge af fjerntliggende steder. 14 ovenfor beskrevne protokol tjener som model for sekundær metastaser. Med et optimalt antal B16-BL6-celler injiceret, kan eksperimentatorer bestemme den relative virkning af et indgivet lægemiddel eller immun cellepopulation, post-neutralisering på cancercelle metastase.
Denne protokol har begrænsninger. De cirkulerende tumorceller er blevet udvalgt for deres evne til at metastasere og er derfor ikke-immunogen, har lavere niveauer af dominerende histokompatibilitetskompleks klasse 1-molekyler. 12. Endvidere pludselige og Clustered indførelse af store antal metastaser er ulig den typisk scenarie i patienter hvor et lille antal metastatiske tumorcellersprede over en længere tidsperiode fra den primære tumor placering. Derudover intravenøst indførte tumorceller er fra vævskultur og ikke af en primær tumor oprindelse. Derfor er disse celler er i modsætning til de sekundære metastaser, der skyldes ændringer i celleadhæsion, migrering, immungenkendelse og modtager orgel etablering. 15,16
En alternativ protokol ville være subkutan injektion af B16 / BL6 til generering af primære tumorer og analyse af de resulterende "spontane" lungemetastaser. Disse "spontane" metastaser har vist sig at indeholde mere heterogenitet end deres "eksperimentelle" modstykker, nærmere svarer til dem af humane patienter. Protokollen er begrænsende på dens evne til at bestemme indflydelsen af en eksperimentel forbindelse på metastase. Med en lateral halevene injektion, kan antallet af melanomceller injiceret i blodbanen tilnærmes via hemocytometer. Med "spontan" metastase, men der er større heterogenitet mellem tumorer, tilføje en ekstra variabel til antallet af resulterende lunge foci. 16
Afslutningsvis halevenen B16-BL6 murint melanom model repræsenterer en simpel model til bestemmelse af indflydelsen af en behandling eller immunterapi på metastase. Ved intravenøst injektion af cirkulerende tumorceller, kan forskerne replikere i nogen grad, patienter post-metastase. I betragtning af de ødelæggende virkninger af metastatiske tumorceller i cancerpatienter, denne model er et stærkt værktøj til forståelse af den flertrinsproces af metastase.
The authors have nothing to disclose.
Delvist understøttet af en National Cancer Institute tilskud 1R03CA172923.
Trypsin | Corning | MT25052CV | |
RPMI 1640 Medium | Corning | MT15040CM | |
Phase Contraast Hemacytometer | Hausser | 02-671-54 | |
Micro-Fine IV Insulin Syringes | BD | 14-829-1D | |
Sterile Alcohol Prep Pads | Fisherbrand | 22-363-750 | |
Mouse Restrainer | Braintree Scientific | NC9999969 | Restrainer choice depends on age/size of mice |
Heating Pad | Harry Schein | NC0012697 | Optional |