Et-trins Negativ kromatografisk oprensning af<em> Helicobacter pylori</em> Neutrofilaktiverende protein overudtrykt i<em> Escherichia coli</em> I Batch Mode
Summary
Et højt udbytte fremgangsmåde til ettrins negativ oprensning af rekombinant Helicobacter pylori neutrofil-aktiverende protein (HP-NAP) overudtrykkes i Escherichia coli ved hjælp af diethylaminoethyl harpikser i batchvis, er beskrevet. HP-NAP renset ved denne metode er til gavn for udviklingen af vacciner, lægemidler, eller diagnostik for H. pylori-associeret sygdomme.
Abstract
Helicobacter pylori neutrofil-aktiverende protein (HP-NAP) er en væsentlig virulensfaktor af Helicobacter pylori (H. pylori). Det spiller en kritisk rolle i H. pylori-induceret gastrisk inflammation ved at aktivere flere medfødte leukocytter, herunder neutrofiler, monocytter og mastceller. De immunogene og immunmodulerende egenskaber af HP-NAP gør det til en potentiel diagnostisk og vaccine kandidat til H. pylori og en ny lægemiddelkandidat til kræftbehandling. For at opnå betydelige mængder oprenset HP-NAP anvendes til dets kliniske anvendelser, til en effektiv fremgangsmåde oprense dette protein med højt udbytte og renhed skal etableres.
I denne protokol, har vi beskrevet en fremgangsmåde til ettrins negativ kromatografisk oprensning af rekombinant HP-NAP overudtrykkes i Escherichia coli (E. coli) ved anvendelse diethylaminoethyl (DEAE) ionbytterharpikser (f.eks. Sephadex) in batch-mode. Rekombinant HP-NAP udgør næsten 70% af det totale protein i E. coli og er næsten fuldt tilbagebetalt i den opløselige fraktion efter cellelysis ved pH 9,0. Under den optimale tilstand ved pH 8,0, er størstedelen af HP-NAP udvundet i den ubundne fraktion, mens de endogene proteiner fra E. coli effektivt fjernet ved harpiksen.
Denne rensning metode bruger negativ tilstand batch kromatografi med DEAE ionbytterharpikser giver funktionel HP-NAP fra E. coli i sin native form med højt udbytte og renhed. Det oprensede HP-NAP kunne yderligere anvendes til forebyggelse, behandling og prognose af H. pylori-associeret sygdomme og cancer terapi.
Introduction
Helicobacter pylori (H. pylori) er en væsentlig årsag til gastritis og mavesår. Denne bakterie er også blevet klassificeret som kræftfremkaldende i mennesker ved Det Internationale Agentur for Kræftforskning, en del af World Health Organization, i 1994. Det er blevet anslået, at forekomsten af H. pylori-infektion er 70% i udviklingslandene og 30-40% i de industrialiserede lande 1. Selvom infektion på H. pylori er faldende i de industrialiserede lande, infektion på H. pylori i udviklingslandene er stadig høj 2. Standarden behandling for at udrydde H. pylori infektion består af administrationen af en protonpumpehæmmer, PPI, og to antibiotika, clarithromycin plus amoxicillin eller metronidazol 3. Men fremkomsten af antibiotikaresistens i H. pylori-relaterede sår terapi tilskynder udviklingen af nye strategier til forebyggelse or helbrede infektionen. Udvikling af forebyggende og / eller terapeutisk vaccination mod H. pylori kunne give en alternativ tilgang til at styre H. pylori-infektion.
Helicobacter pylori neutrofil-aktiverende protein (HP-NAP), en væsentlig virulensfaktor af H pylori, blev først identificeret i vand ekstrakter af H. pylori med evnen til at aktivere neutrofiler til at adhærere til endotelceller og producere reaktive oxygenarter (ROS) 4. Neutrofil infiltration af maveslimhinden fundet i H. pylori-inficerede patienter med aktiv gastritis kan resultere i inflammation og vævsskade af maven. Således kan HP-NAP spille en patologisk rolle ved at aktivere neutrofiler at inducere gastrisk inflammation, hvilket yderligere bevirker ulcus eller H. pylori-associeret gastrisk sygdomme. Ikke desto mindre, HP-NAP er en potentiel kandidat til kliniske anvendelser 5,6. På grund af den immunogene og immunmodulerende proejendommene af HP-NAP, kan dette protein anvendes til at udvikle vacciner, terapeutiske midler og diagnostiske værktøjer. Et klinisk forsøg er gennemført for anvendelse af rekombinant HP-NAP som en af komponenterne i et protein vaccine mod H. pylori. Denne vaccine består af rekombinant HP-NAP, cytotoksin-associeret gen A (CagA), og vakuolerende cytotoksin A (VacA) proteiner formuleret med aluminiumhydroxid og er yderligere blevet demonstreret at være sikkert og immunogent i mennesker 7. Også, HP-NAP virker som en potent immunmodulator til at udløse T-hjælper type 1 (Th1) -polarized immunresponser til cancerterapi 8 og at nedregulere Th2-medierede immunresponser fremkaldt af allergiske reaktioner og parasitære infektioner 9,10. Som for diagnostik, har rekombinant HP-NAP-baserede ELISA blevet anvendt til påvisning af serumantistoffer mod HP-NAP i H. pylori inficerede patienter 11. En undersøgelse viste, at niveauet af HP-NAP-specifikke antistoffer i sera fra H. pylori inficerede patienter med mavekræft var signifikant højere end fra patienter med kronisk gastritis 12. En anden undersøgelse viste også, at serum antistoffer mod HP-NAP er forbundet med tilstedeværelsen af ikke-mavemunden gastrisk adenocarcinom 13. Således kan rekombinant HP-NAP-baserede ELISA anvendes til at måle serum antistoffer mod HP-NAP til prognose af gastrisk cancer hos H. pylori-inficerede patienter. Tilsammen kan det oprensede HP-NAP yderligere anvendes til forebyggelse, behandling og prognose af H. pylori-associeret sygdomme og cancer terapi.
Blandt de mange metoder, der anvendes til oprensning af rekombinant HP-NAP udtrykt i Escherichia coli (E. coli) i sin native form rapporteret hidtil, et andet oprensningstrin involverer gelfiltreringskromatografi er nødvendig for at opnå særdeles rene HP-NAP 14-16 . Her, en fremgangsmåde under anvendelse negativ modus batch kromatografi meddiethylaminoethyl (DEAE) ionbytterharpikser er beskrevet for oprensning af HP-NAP overudtrykt i E. coli med højt udbytte og høj renhed. Denne rensning teknik var baseret på bindingen af værtscelleproteiner og / eller andre end HP-NAP til harpiksen urenheder. Ved pH 8,0, er næsten ingen andre proteiner undtagen HP-NAP genvundet fra den ubundne fraktion. Denne rensning tilgang med DEAE ionbytningskromatografi som negativ er enkel og tidsbesparende ved at tillade oprensning af rekombinant HP-NAP via et-trins kromatografi gennem indsamling af den ubundne fraktion. Ud over HP-NAP, flere andre biomolekyler, såsom vira 17, immunoglobulin G (IgG) 18, hæmoglobin 19, proteinphosphatase 20, og virulensfaktor flagellin 21, også er blevet rapporteret at renses ved ionbytningskromatografi i negativ mode. Den negative modus foretrækkes til ionbytningskromatografi hvis urenheder er den mindreårigekomponenter til stede i prøven underkastes oprenses 22. Anvendelsen af negative chromatografi i rensning af naturlige eller rekombinante biomolekyler er for nylig blevet revideret 23.
Denne rapport giver en trinvis protokol for ekspression af rekombinant HP-NAP i E. coli, lysis af cellerne, og oprensning af HP-luven negativ modus batch-kromatografi med DEAE ionbytterharpikser. Hvis et ønsket til oprensning protein er egnet til ionbytningskromatografi i negativ modus, kan den beskrevne protokol også tilpasses som et udgangspunkt for udvikling af en rensningsproces.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den negative tilstand batch-kromatografi med DEAE anionbytterharpikser præsenteret her er egnet til oprensning af rekombinant HP-NAP overudtrykkes i E. coli. PH-værdierne af de anvendte buffere i trinnene cellelyse og oprensning er meget afgørende for at sikre opløseligheden af HP-NAP i E. coli lysater og effektiv separering af rekombinant HP-NAP fra værtscelleurenheder hhv. Bakterieceller bør lyseres ved pH 9,0, og den negative oprensning bør udføres ved pH 8,0 til opnåelse af HP-NAP i højt …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Chao-Sheng Cheng at National Tsing Hua University, Taiwan, for performing the circular dichroism measurement. We also thank Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA, for providing the anti-HP-NAP monoclonal antibody. We appreciate Drs. Han-Wen Chang and Chung-Chu Chen at Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, for providing advice for IRB application, Mr. Te-Lung Tsai at the Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, for supervising the analysis of isolated neutrophils, and Ms. Ju-Chen Weng at National Tsing Hua University, Taiwan, for her technical assistance. This work was supported by grants from the Ministry of Science and Technology of Taiwan (MOST 104-2311-B-007-003, NSC101-2311-B-007-007 and NSC98-2311-B-007-006-MY3), the Joint Research Program of National Tsing Hua University and Mackay Memorial Hospital (100N7727E1, 101N2727E1, 103N2773E1), and the research program of National Tsing Hua University (104N2052E1).
Materials
| Material | |||
| pET42a-NAP | N/A | N/A | prepared as described in Supplementary data of Refernce 15 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08018317 |
| E. coli BL21 (DE3) | Thermo Fisher Scientific Inc | C6000-03 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003 |
| Kanamycin | Amresco | 25389-94-0 | http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | MD Biomedical Inc | 101-367-93-1 | http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&supplier=search&name =IPTG%20 |
| phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | 10837091001 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en®ion=TW |
| N-alpha-tosyl-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK) | Sigma-Aldrich | T7254 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en®ion=TW |
| N-tosyl-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK) | Sigma-Aldrich | T4376 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en®ion=TW |
| Bio-Rad protein assay dye reagent concentrate | Bio‐Rad | 500-0006 | for protein quantitation http://www.bio-rad.com/en-us/sku/5000006-bio-rad-protein-assay-dye-reagent-concentrate |
| Protein standard (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | P5619 | a standard protein for Bio-Rad Protein Assay http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en®ion=TW |
| DEAE–Sephadex A-25 chloride form | Sigma-Aldrich | A25120 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en®ion=TW |
| Spectrum/Por dialysis tubing | Spectrum Laboratories | 132720 | with molecular weight cutoff of 14 kDa http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720; |
| Acrodisc® units with Mustang® E membrane | Pall | MSTG25E3 | for endotoxin removal; operated at flow rates ranging from 1 to 4 ml/min http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992 |
| mouse monoclonal antibody MAb 16F4 | N/A | N/A | raised against the purified HP-NAP of H. pylori strain NCTC 11637 as described in Refernce 23; A gift from Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X10017585 |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg | GE Healthcare Life Sciences | 28989335 | for gel filtration chromatography http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335 |
| PlusOne silver staining kit, protein | GE Healthcare Life Sciences | 17-1150-01 | http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001 |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Life Sciences | 17-1440-02 | for density gradient centrifugation to purify human neutrophils http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure _16963/17144002 |
| Flat bottom 96-well white plate | Thermo Fisher Scientific Inc | 236108 | http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html |
| Luminol | Sigma-Aldrich | A8511 | protected from light http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en®ion=TW |
| Expand long template PCR system | Sigma-Aldrich | 11681834001 | source of High Fidelity PCR enzyme mix http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en®ion=TW |
| Dpn I | New England Biolabs | R0176S | https://www.neb.com/products/r0176-dpni |
| Xho I | New England Biolabs | R0146S | https://www.neb.com/products/r0146-xhoi |
| E. coli DH5α | Thermo Fisher Scientific Inc | 18265-017 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017 |
| Name | Company | Product Number | Comments |
| Equipment | |||
| U-2800 double beam UV/VIS spectrophotometer | Hitachi | N/A | out of market and upgraded to a new model http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers |
| EmulsiFlex-C3 high pressure homogenizer | Avestin Inc | C315320 | http://www.avestin.com/English/c3page.html |
| Hitachi Koki himac CP80WX general ultracentrifuge | Hitachi Koki Co | 90106401 | for separation of the soluble and insoluble protein fractions from E. coli lysates http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html |
| ÄKTA FPLC | GE Healthcare Life Sciences | 18-1900-26 | for gel filtration chromatography http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026 |
| Aviv model 62ADS CD spectrophotometer | Aviv Biomedical | N/A | out of market and upgraded to a new model http://www.avivbiomedical.com/circular.php |
| LAS-3000 imaging system | Fujifilm | N/A | discontinued and replaced http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810 |
| Wallac 1420 (Victor2) multilabel counter | Perkin-Elmer | 1420-018 | for chemiluminescence detection http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018 |
References
- Brunette, G. W., et al. Chapter 3, Infectious diseases related to travel. CDC Health Information for International Travel 2016. , (2015).
- Bauer, B., Meyer, T. F. The human gastric pathogen Helicobacter pylori its association with gastric cancer and ulcer disease. Ulcers. 2011, 340157 (2011).
- Malfertheiner, P., et al. Management of Helicobacter pylori infection–the Maastricht IV/ Florence Consensus Report. Gut. Gut. 61 (5), 646-664 (2012).
- Evans, D. J., et al. Characterization of a Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Infect. Immun. 63 (6), 2213-2220 (1995).
- Fu, H. W. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein: from molecular pathogenesis to clinical applications. World J. Gastroenterol. 20 (18), 5294-5301 (2014).
- de Bernard, M., D’Elios, M. M. The immune modulating activity of the Helicobacter pylori HP-NAP: Friend or foe?. Toxicon. 56 (7), 1186-1192 (2010).
- Malfertheiner, P., et al. Safety and immunogenicity of an intramuscular Helicobacter pylori in noninfected volunteers: a phase I study. Gastroenterology. 135 (3), 787-795 (2008).
- Codolo, G., et al. HP-NAP inhibits the growth of bladder cancer in mice by activating a cytotoxic Th1 response. Cancer Immunol. Immunother. 61 (1), 31-40 (2012).
- Codolo, G., et al. The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori Th2 inflammation in ovalbumin-induced allergic asthma. Cell. Microbiol. 10 (11), 2355-2363 (2008).
- Del Prete, ., G, , et al. Immunosuppression of TH2 responses in Trichinella spiralis by Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. J. Allergy Clin. Immunol. 122 (5), 908-913.e5 (2008).
- Tang, R. X., Luo, D. J., Sun, A. H., Yan, J. Diversity of Helicobacter pylori in expression of antigens and induction of antibodies. World J. Gastroenterol. 14 (30), 4816-4822 (2008).
- Long, M., Luo, J., Li, Y., Zeng, F. Y., Li, M. Detection and evaluation of antibodies against neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori in patients with gastric cancer. World J. Gastroenterol. 15 (19), 2381-2388 (2009).
- Song, H., et al. A CagA-independent cluster of antigens related to the risk of noncardia gastric cancer: associations between Helicobacter pylori and gastric adenocarcinoma explored by multiplex serology. Int. J. Cancer. 134 (12), 2942-2950 (2014).
- Kottakis, F., et al. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein activates neutrophils by its C-terminal region even without dodecamer formation, which is a prerequisite for DNA protection–novel approaches against Helicobacter pylori inflammation. FEBS J. 275 (2), 302-317 (2008).
- Thoreson, A. C., et al. Differences in surface-exposed antigen expression between Helicobacter pylori isolated from duodenal ulcer patients and from asymptomatic subjects. J. Clin. Microbiol. 38 (9), 3436-3441 (2000).
- Wang, C. A., Liu, Y. C., Du, S. Y., Lin, C. W., Fu, H. W. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein promotes myeloperoxidase release from human neutrophils. Biochem. Biophys. Res. Commun. 377 (1), 52-56 (2008).
- Iyer, G., et al. Reduced surface area chromatography for flow-through purification of viruses and virus like particles. J. Chromatogr. A. 1218 (26), 3973-3981 (2011).
- Wongchuphan, R., et al. Purification of rabbit polyclonal immunoglobulin G using anion exchangers. Process Biochem. 46 (1), 101-107 (2011).
- Lu, X., Zhao, D., Su, Z. Purification of hemoglobin by ion exchange chromatography in flow-through mode with PEG as an escort. Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 32 (2), 209-227 (2004).
- Brooks, S. P., Storey, K. B. Purification and characterization of a protein phosphatase that dephosphorylates pyruvate kinase in an anoxia tolerant animal. Biochem. Mol. Biol. Int. 38 (6), 1223-1234 (1996).
- Gewirtz, A. T., et al. Salmonella typhimurium translocates flagellin across intestinal epithelia, inducing a proinflammatory response. J. Clin. Invest. 107 (1), 99-109 (2001).
- Levison, P. R. Large-scale ion-exchange column chromatography of proteins: Comparison of different formats. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 790 (1-2), 17-33 (2003).
- Lee, M. F. X., Chan, E. S., Tey, B. T. Negative chromatography: Progress, applications and future perspectives. Process Biochem. 49 (6), 1005-1011 (2014).
- Yang, Y. C., et al. High yield purification of Helicobacter pylori neutrophil-activating protein overexpressed in Escherichia coli. BMC biotechnol. 15 (23), (2015).
- Iankov, I. D., Haralambieva, I. H., Galanis, E. Immunogenicity of attenuated measles virus engineered to express Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Vaccine. 29 (8), 1710-1720 (2011).
- Shih, K. S., et al. One-step chromatographic purification of Helicobacter pylori protein expressed in Bacillus subtilis. PLoS One. 8 (4), e60786 (2013).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC biotechnol. 8 (91), (2008).
- Karnik, A., Karnik, R., Grefen, C. SDM-assist software to design site-directed mutagenesis primers introducing ‘silent’ restriction sites. BMC bioinformatics. 14 (105), (2013).
