Enstegs Negativ kromatografisk rening av<em> Helicobacter pylori</em> Neutrofilaktiverande Protein överuttryckt i<em> Escherichia coli</em> I batch-läge
Summary
En hög räntemetoden för ett steg negativ rening av rekombinant Helicobacter pylori neutrofilaktiverande protein (HP-NAP) överuttryckt i Escherichia coli genom att använda dietylaminoetyl hartser i satsvis beskrivs. HP-NAP renas genom denna metod är gynnsam för utvecklingen av vacciner, läkemedel eller diagnostik för H. pylori -associated sjukdomar.
Abstract
Helicobacter pylori neutrofil-aktiverande protein (HP-NAP) är en viktig virulensfaktor av Helicobacter pylori (H. pylori). Den spelar en avgörande roll i H. pylori-inducerad gastrisk inflammation genom att aktivera flera medfödda leukocyter inklusive neutrofiler, monocyter och mastceller. De immunogena och immunmodulerande egenskaper hos HP-NAP gör det en potentiell diagnos och vaccinkandidat för H. pylori och en ny läkemedelskandidat för cancerbehandling. I syfte att erhålla väsentliga mängder av renat HP-NAP används för dess kliniska tillämpningar, till en effektiv metod att rena detta protein med högt utbyte och renhet behöver upprättas.
I detta protokoll har vi beskrivit en metod för en-stegs negativ kromatografisk rening av rekombinant HP-NAP överuttryckt i Escherichia coli (E. coli) genom användning av dietylaminoetyl (DEAE) jonbytarmassa (eg., Sephadex) in satsvis. Rekombinant HP-NAP utgör nästan 70% av det totala proteinet i E. coli och är nästan helt återhämtat sig i den lösliga fraktionen efter cellys vid pH 9,0. Med optimal kondition vid pH 8,0, är majoriteten av HP-NAP utvanns i den obundna fraktionen medan de endogena proteiner från E. coli effektivt avlägsnas genom hartset.
Denna reningsmetod med användning av negativ läge batch-kromatografi med DEAE jonbytarmassor ger funktionell HP-NAP från E. coli i dess nativa form med högt utbyte och renhet. Det renade HP-NAP skulle kunna utnyttjas ytterligare för förebyggande, behandling och prognos av H. pylori -associated sjukdomar samt cancerterapi.
Introduction
Helicobacter pylori (H. pylori) är en viktig orsak till gastrit och magsår. Denna bakterie har också klassificerats som cancerframkallande hos människor från International Agency for Research on Cancer, en del av Världshälsoorganisationen, 1994. Det har uppskattats att förekomsten av H. pylori-infektion är 70% i utvecklingsländerna och 30-40% i industriländerna 1. Även om infektionen hastigheten för H. pylori minskar i industriländerna, infektionsfrekvensen av H. pylori i utvecklingsländerna är fortfarande hög två. Standardbehandlingen för att utrota H. pylori-infektion består av administrering av en protonpumpshämmare, PPI, och två antibiotika, klaritromycin plus amoxicillin eller metronidazol 3. Men ökningen av antibiotikaresistens hos H. pylori -relaterade sår terapi uppmanar utvecklingen av nya strategier för att förebygga or bota infektionen. Utveckling av förebyggande och / eller terapeutisk vaccination mot H. pylori kan ge ett alternativt tillvägagångssätt för att styra H. pylori-infektion.
Helicobacter pylori neutrofil-aktiverande protein (HP-NAP), en viktig virulensfaktor av H pylori, identifierades först i extrakt vatten från H. pylori med förmågan att aktivera neutrofiler att vidhäfta till endotelceller och producera reaktiva syreradikaler (ROS) 4. Neutrofil infiltration av magslemhinnan hittas i H. pylori-infekterade patienter med aktiv gastrit kan resultera i inflammation och vävnadsskada i magen. Således kan HP-NAP spela en patologisk roll genom att aktivera neutrofiler att inducera gastrisk inflammation, vilket ytterligare orsakar magsår eller H. pylori -associated gastric sjukdomar. Ändå är HP-NAP en potentiell kandidat för kliniska tillämpningar 5,6. På grund av den immunogena och immunmodulerande proegenskaper till HP-NAP, kunde detta protein användas för att utveckla vacciner, terapeutiska medel och diagnostiska verktyg. En klinisk prövning har genomförts för att använda rekombinant HP-NAP som en av komponenterna i ett proteinvaccin mot H. pylori. Detta vaccin består av rekombinant HP-NAP, cellgift associerad gen A (CagA) och vakuoliserande cytotoxin A (VacA) proteiner formuleras med aluminiumhydroxid och har dessutom visat sig vara säker och immunogen i människor 7. Också fungerar HP-NAP som en potent immunmodulator för att utlösa T-hjälpar typ 1 (Th1) -polarized immunsvar för cancerterapi 8 och att nedreglera Th2-medierade immunsvar som framkallas av allergiska reaktioner och parasitinfektioner 9,10. När det gäller diagnostik, har rekombinant HP-NAP-baserade ELISA använts för att påvisa serumantikroppar mot HP-NAP i H. pylori infekterade patienter 11. En studie visade att nivån av HP-NAP-specifika antikroppar i sera från H. pylori infekterade patienter med magcancer var betydligt högre än den från patienter med kronisk gastrit 12. En annan studie visade också att serumantikroppar mot HP-NAP är associerade med närvaron av icke-kardia magcancer 13. Således kan rekombinant HP-NAP-baserade ELISA appliceras för att detektera serumantikroppar mot HP-NAP för prognos av magcancer i H. pylori-infekterade patienter. Sammantaget kan det renade HP-NAP utnyttjas ytterligare för förebyggande, behandling och prognos av H. pylori -associated sjukdomar samt cancerterapi.
Bland flera metoder som används för rening av rekombinant HP-NAP uttryckts i Escherichia coli (E. coli) i dess nativa form rapporterats hittills, behövs ett andra reningssteg inbegriper gelfiltreringskromatografi för att erhålla högren HP-NAP 14-16 . Här, en metod som använder negativ läge batch-kromatografi meddietylaminoetyl (DEAE) jonbytarhartser beskrivs för rening av HP-NAP överuttryckt i E. coli med högt utbyte och hög renhet. Denna reningsteknik baserades på den bindning av värdcellproteiner och / eller andra än HP-NAP till hartset föroreningar. Vid pH 8,0, är nästan inga andra proteiner förutom HP-NAP utvinnas från den obundna fraktionen. Detta renings tillvägagångssätt och använda DEAE jonbyteskromatografi i negativt driftläge är enkel och tidsbesparande genom att tillåta rening av rekombinant HP-NAP via ett-steg-kromatografi genom insamling av den obundna fraktionen. Förutom HP-NAP, flera andra biomolekyler, såsom virus 17 immunglobulin G (IgG) 18, hemoglobin 19, proteinfosfatas 20, och virulensfaktor flagellin 21, har också rapporterats som skall renas genom jonbyteskromatografi i negativ läge. Det negativa sättet är att föredra för jonbyteskromatografi, om föroreningar är den mindrekomponenter som är närvarande i provet utsattes för skall renas 22. Tillämpningen av negativa kromatografi i rening av naturliga eller rekombinanta biomolekyler har nyligen över 23.
Denna rapport ger en steg för steg-protokoll för uttryck av rekombinant HP-NAP i E. coli, lysering av cellerna, och rening av HP-NAP med användning av negativ läge batch-kromatografi med DEAE jonbyteshartser. Om ett protein som önskas för rening är lämplig för jonbyteskromatografi i negativ-läge, kan den beskrivna protokollet även anpassas som en utgångspunkt för utvecklingen av en reningsprocess.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det negativa sättet sats-kromatografi med DEAE anjonbytarhartser som presenteras här är lämplig för rening av rekombinant HP-NAP överuttryckt i E. coli. PH-värdena för de buffertar som användes i stegen i cellys och rening är mycket avgörande för att säkerställa lösligheten av HP-NAP i E. coli-lysat och effektiv separation av rekombinant HP-NAP från värdcellföroreningar, respektive. Bakterieceller bör lyserades vid pH 9,0, och den negativa reningen bör utföras vid pH 8,0 för att e…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Chao-Sheng Cheng at National Tsing Hua University, Taiwan, for performing the circular dichroism measurement. We also thank Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA, for providing the anti-HP-NAP monoclonal antibody. We appreciate Drs. Han-Wen Chang and Chung-Chu Chen at Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, for providing advice for IRB application, Mr. Te-Lung Tsai at the Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, for supervising the analysis of isolated neutrophils, and Ms. Ju-Chen Weng at National Tsing Hua University, Taiwan, for her technical assistance. This work was supported by grants from the Ministry of Science and Technology of Taiwan (MOST 104-2311-B-007-003, NSC101-2311-B-007-007 and NSC98-2311-B-007-006-MY3), the Joint Research Program of National Tsing Hua University and Mackay Memorial Hospital (100N7727E1, 101N2727E1, 103N2773E1), and the research program of National Tsing Hua University (104N2052E1).
Materials
| Material | |||
| pET42a-NAP | N/A | N/A | prepared as described in Supplementary data of Refernce 15 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08018317 |
| E. coli BL21 (DE3) | Thermo Fisher Scientific Inc | C6000-03 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003 |
| Kanamycin | Amresco | 25389-94-0 | http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | MD Biomedical Inc | 101-367-93-1 | http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&supplier=search&name =IPTG%20 |
| phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | 10837091001 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en®ion=TW |
| N-alpha-tosyl-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK) | Sigma-Aldrich | T7254 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en®ion=TW |
| N-tosyl-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK) | Sigma-Aldrich | T4376 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en®ion=TW |
| Bio-Rad protein assay dye reagent concentrate | Bio‐Rad | 500-0006 | for protein quantitation http://www.bio-rad.com/en-us/sku/5000006-bio-rad-protein-assay-dye-reagent-concentrate |
| Protein standard (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | P5619 | a standard protein for Bio-Rad Protein Assay http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en®ion=TW |
| DEAE–Sephadex A-25 chloride form | Sigma-Aldrich | A25120 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en®ion=TW |
| Spectrum/Por dialysis tubing | Spectrum Laboratories | 132720 | with molecular weight cutoff of 14 kDa http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720; |
| Acrodisc® units with Mustang® E membrane | Pall | MSTG25E3 | for endotoxin removal; operated at flow rates ranging from 1 to 4 ml/min http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992 |
| mouse monoclonal antibody MAb 16F4 | N/A | N/A | raised against the purified HP-NAP of H. pylori strain NCTC 11637 as described in Refernce 23; A gift from Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X10017585 |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg | GE Healthcare Life Sciences | 28989335 | for gel filtration chromatography http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335 |
| PlusOne silver staining kit, protein | GE Healthcare Life Sciences | 17-1150-01 | http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001 |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Life Sciences | 17-1440-02 | for density gradient centrifugation to purify human neutrophils http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure _16963/17144002 |
| Flat bottom 96-well white plate | Thermo Fisher Scientific Inc | 236108 | http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html |
| Luminol | Sigma-Aldrich | A8511 | protected from light http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en®ion=TW |
| Expand long template PCR system | Sigma-Aldrich | 11681834001 | source of High Fidelity PCR enzyme mix http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en®ion=TW |
| Dpn I | New England Biolabs | R0176S | https://www.neb.com/products/r0176-dpni |
| Xho I | New England Biolabs | R0146S | https://www.neb.com/products/r0146-xhoi |
| E. coli DH5α | Thermo Fisher Scientific Inc | 18265-017 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017 |
| Name | Company | Product Number | Comments |
| Equipment | |||
| U-2800 double beam UV/VIS spectrophotometer | Hitachi | N/A | out of market and upgraded to a new model http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers |
| EmulsiFlex-C3 high pressure homogenizer | Avestin Inc | C315320 | http://www.avestin.com/English/c3page.html |
| Hitachi Koki himac CP80WX general ultracentrifuge | Hitachi Koki Co | 90106401 | for separation of the soluble and insoluble protein fractions from E. coli lysates http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html |
| ÄKTA FPLC | GE Healthcare Life Sciences | 18-1900-26 | for gel filtration chromatography http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026 |
| Aviv model 62ADS CD spectrophotometer | Aviv Biomedical | N/A | out of market and upgraded to a new model http://www.avivbiomedical.com/circular.php |
| LAS-3000 imaging system | Fujifilm | N/A | discontinued and replaced http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810 |
| Wallac 1420 (Victor2) multilabel counter | Perkin-Elmer | 1420-018 | for chemiluminescence detection http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018 |
References
- Brunette, G. W., et al. Chapter 3, Infectious diseases related to travel. CDC Health Information for International Travel 2016. , (2015).
- Bauer, B., Meyer, T. F. The human gastric pathogen Helicobacter pylori its association with gastric cancer and ulcer disease. Ulcers. 2011, 340157 (2011).
- Malfertheiner, P., et al. Management of Helicobacter pylori infection–the Maastricht IV/ Florence Consensus Report. Gut. Gut. 61 (5), 646-664 (2012).
- Evans, D. J., et al. Characterization of a Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Infect. Immun. 63 (6), 2213-2220 (1995).
- Fu, H. W. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein: from molecular pathogenesis to clinical applications. World J. Gastroenterol. 20 (18), 5294-5301 (2014).
- de Bernard, M., D’Elios, M. M. The immune modulating activity of the Helicobacter pylori HP-NAP: Friend or foe?. Toxicon. 56 (7), 1186-1192 (2010).
- Malfertheiner, P., et al. Safety and immunogenicity of an intramuscular Helicobacter pylori in noninfected volunteers: a phase I study. Gastroenterology. 135 (3), 787-795 (2008).
- Codolo, G., et al. HP-NAP inhibits the growth of bladder cancer in mice by activating a cytotoxic Th1 response. Cancer Immunol. Immunother. 61 (1), 31-40 (2012).
- Codolo, G., et al. The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori Th2 inflammation in ovalbumin-induced allergic asthma. Cell. Microbiol. 10 (11), 2355-2363 (2008).
- Del Prete, ., G, , et al. Immunosuppression of TH2 responses in Trichinella spiralis by Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. J. Allergy Clin. Immunol. 122 (5), 908-913.e5 (2008).
- Tang, R. X., Luo, D. J., Sun, A. H., Yan, J. Diversity of Helicobacter pylori in expression of antigens and induction of antibodies. World J. Gastroenterol. 14 (30), 4816-4822 (2008).
- Long, M., Luo, J., Li, Y., Zeng, F. Y., Li, M. Detection and evaluation of antibodies against neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori in patients with gastric cancer. World J. Gastroenterol. 15 (19), 2381-2388 (2009).
- Song, H., et al. A CagA-independent cluster of antigens related to the risk of noncardia gastric cancer: associations between Helicobacter pylori and gastric adenocarcinoma explored by multiplex serology. Int. J. Cancer. 134 (12), 2942-2950 (2014).
- Kottakis, F., et al. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein activates neutrophils by its C-terminal region even without dodecamer formation, which is a prerequisite for DNA protection–novel approaches against Helicobacter pylori inflammation. FEBS J. 275 (2), 302-317 (2008).
- Thoreson, A. C., et al. Differences in surface-exposed antigen expression between Helicobacter pylori isolated from duodenal ulcer patients and from asymptomatic subjects. J. Clin. Microbiol. 38 (9), 3436-3441 (2000).
- Wang, C. A., Liu, Y. C., Du, S. Y., Lin, C. W., Fu, H. W. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein promotes myeloperoxidase release from human neutrophils. Biochem. Biophys. Res. Commun. 377 (1), 52-56 (2008).
- Iyer, G., et al. Reduced surface area chromatography for flow-through purification of viruses and virus like particles. J. Chromatogr. A. 1218 (26), 3973-3981 (2011).
- Wongchuphan, R., et al. Purification of rabbit polyclonal immunoglobulin G using anion exchangers. Process Biochem. 46 (1), 101-107 (2011).
- Lu, X., Zhao, D., Su, Z. Purification of hemoglobin by ion exchange chromatography in flow-through mode with PEG as an escort. Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 32 (2), 209-227 (2004).
- Brooks, S. P., Storey, K. B. Purification and characterization of a protein phosphatase that dephosphorylates pyruvate kinase in an anoxia tolerant animal. Biochem. Mol. Biol. Int. 38 (6), 1223-1234 (1996).
- Gewirtz, A. T., et al. Salmonella typhimurium translocates flagellin across intestinal epithelia, inducing a proinflammatory response. J. Clin. Invest. 107 (1), 99-109 (2001).
- Levison, P. R. Large-scale ion-exchange column chromatography of proteins: Comparison of different formats. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 790 (1-2), 17-33 (2003).
- Lee, M. F. X., Chan, E. S., Tey, B. T. Negative chromatography: Progress, applications and future perspectives. Process Biochem. 49 (6), 1005-1011 (2014).
- Yang, Y. C., et al. High yield purification of Helicobacter pylori neutrophil-activating protein overexpressed in Escherichia coli. BMC biotechnol. 15 (23), (2015).
- Iankov, I. D., Haralambieva, I. H., Galanis, E. Immunogenicity of attenuated measles virus engineered to express Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Vaccine. 29 (8), 1710-1720 (2011).
- Shih, K. S., et al. One-step chromatographic purification of Helicobacter pylori protein expressed in Bacillus subtilis. PLoS One. 8 (4), e60786 (2013).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC biotechnol. 8 (91), (2008).
- Karnik, A., Karnik, R., Grefen, C. SDM-assist software to design site-directed mutagenesis primers introducing ‘silent’ restriction sites. BMC bioinformatics. 14 (105), (2013).
