This paper describes a method for the measurement of fuel oxidation in Drosophila melanogaster in which trace amounts of specific radiolabeled metabolic substrates are fed to flies. The exhaled radiolabeled CO2 that is a produced from fuel oxidation is collected and measured.
ड्रोसोफिला आनुवंशिकी की शक्ति तेजी से हार्मोन संकेत और चयापचय के सवाल करने के लिए और इस जीव में मानव रोग के मॉडल के विकास के लिए लागू किया जा रहा है। इस तरह के चयापचय दर के रूप में मानकों के मापन के लिए संवेदनशील तरीकों जैसे फल मक्खी के रूप में शरीर विज्ञान और छोटे जानवरों में बीमारी की समझ ड्राइव करने के लिए आवश्यक हैं। विधि यहाँ वर्णित जैसे ग्लूकोज या फैटी एसिड के रूप में 14 सी-लेबल substrates की मात्रा का पता लगाने युक्त खाना खिलाया वयस्क मक्खियों की कम संख्या में ईंधन ऑक्सीकरण का आकलन है। खिला अवधि और किसी भी अतिरिक्त प्रयोगात्मक जोड़तोड़ के बाद, मक्खियों जाल के साथ छाया हुआ लघु ट्यूब, जो तब उस जाल exhaled KOH संतृप्त फिल्टर पेपर युक्त कांच की शीशियों में रखा जाता है करने के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं, radiolabeled सीओ 2 पोटेशियम बिकारबोनिट के रूप में radiolabeled substrates के ऑक्सीकरण से उत्पन्न, KHCO 3। यह radiolabeled बिकारबोनिट जगमगाहट गिनती से मापा जाता है। इस AQ हैईंधन ऑक्सीकरण के अध्ययन के लिए, uantitative प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, और सरल दृष्टिकोण। radiolabeled ग्लूकोज, फैटी एसिड, या एमिनो एसिड का इस्तेमाल इस तरह के भोजन और उपवास के रूप में और विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि में अलग अलग परिस्थितियों में ऊर्जा चयापचय के लिए इन विभिन्न ईंधन के स्रोतों के योगदान के निर्धारण की अनुमति देता है। यह अन्य विवो ऊर्जा चयापचय में मापने के लिए इस्तेमाल किया दृष्टिकोण का पूरक है और चयापचय विनियमन की समझ को आगे करना चाहिए।
मॉडल जीव ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में काम आनुवंशिक सिद्धांतों, विकास की प्रक्रिया, विकास, उम्र बढ़ने, व्यवहार, प्रतिरक्षा और मानव रोग 1,2 को समझने के लिए बहुत योगदान दिया। ड्रोसोफिला में आनुवंशिक और सेल जैविक दृष्टिकोण के असंख्य इन क्षेत्रों में प्रगति को प्रेरित किया है। हालांकि, फल मक्खी में चयापचय के अध्ययन, और धीरे धीरे विकसित किया गया है इस तरह के एक छोटे से जानवर में चयापचय मापदंडों को मापने में कठिनाइयों के बड़े हिस्से में कारण। ड्रोसोफिला मधुमेह जैसे मानव रोगों के अध्ययन के लिए एक मॉडल के रूप में प्रयोग में और वृद्धि और विभिन्न विकृतियों के लिए चयापचय के योगदान को समझने के लिए ब्याज क्षेत्र को विकसित करने और इस जीव 3,4 के लिए चयापचय तकनीक अनुकूल करने के लिए धक्का दिया गया है।
विश्वसनीय तरीके अब फल मक्खी में चयापचय मानकों के एक नंबर की माप के लिए उपलब्ध हैं। उदाहरण के लिए, यह भोजन का सेवन आकलन करने के लिए सीधा है <s> 5 अप, संग्रहीत ट्राइग्लिसराइड्स और ग्लाइकोजन के रूप में अच्छी तरह के रूप में ग्लूकोज का स्तर और घूम hemolymph मक्खी, trehalose, जो ग्लूकोज 4 के दो अणुओं से बना एक disaccharide है में प्रमुख घूम चीनी का स्तर। चयापचय ट्रेसर का उपयोग इस तरह के भंडारण रूपों ग्लाइकोजन और ट्राइग्लिसराइड्स से 6 ग्लूकोज के रूप में आहार और अवशोषित पोषक तत्वों के रूपांतरण से पोषक तत्व अवशोषण के अध्ययन के लिए सक्षम है। चयापचय दर फल ऑक्सीजन की खपत 7.8 और कार्बन डाइऑक्साइड की माप के माध्यम से उड़ (सीओ 2) के उत्पादन में मूल्यांकन किया जा सकता है। साइट्रिक एसिड चक्र दो-कार्बन इकाइयों कि एसिटाइल coenzyme एक (सीओए) है, जो आहार और संग्रहीत कार्बोहाइड्रेट और फैटी एसिड के चयापचय से प्राप्त होता है के रूप में चक्र में प्रवेश कर सकते हैं ऑक्सीकरण होता। चक्र के प्रत्येक बारी जीटीपी (या एटीपी) में से हर एक अणु और इलेक्ट्रॉन दाता FADH 2, NADH के तीन अणुओं, और अपशिष्ट उत्पाद सीओ 2 के दो अणुओं उत्पन्न करता है। सीओ 2 उत्पादन कर सकते हैंबेसल चयापचय दर का अनुमान किया जा सकता है। कुल सीओ 2 उत्पादन वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध है या हस्तनिर्मित respirometers 9-10,11 के उपयोग के माध्यम ड्रोसोफिला में मात्रा निर्धारित किया जा सकता है।
कुल सीओ 2 उत्पादन की माप, खासकर जब हे 2 खपत की माप के साथ मिलकर, पूरे शरीर को ऊर्जा चयापचय में बहुमूल्य अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। हालांकि, इस उपाय के पोषक तत्व की पहचान नहीं करता adenosine triphosphate (एटीपी) के उत्पादन के लिए ऑक्सीकरण जा रहा है। कार्बोहाइड्रेट, फैटी एसिड, प्रोटीन और पोषक तत्वों के तीन प्रमुख वर्गों साइट्रिक एसिड चक्र निम्नलिखित रूपांतरण एसिटाइल को सीओए में प्रवेश कर सकते हैं। ग्लूकोज-6-फॉस्फेट, आहार ग्लूकोज या संग्रहीत ग्लाइकोजन से निकाली गई, पाइरूवेट कि पाइरूवेट डिहाइड्रोजनेज द्वारा decarboxylated है एसिटाइल सीओए के लिए फार्म के लिए परिवर्तित किया जा सकता है। सीओए एसिटाइल एसएस ऑक्सीकरण पैदावार कि तब साइट्रिक एसिड चक्र में प्रवेश करती द्वारा आहार से या संग्रहीत ट्राइग्लिसराइड्स से निकाली गई फैटी एसिड का टूटना। आखिरकार, अमीनो एसिड के बहुमत ऐसे अल्फा-ketoglutarate के रूप में सीओए या साइट्रिक एसिड चक्र मध्यवर्ती एसिटाइल, पाइरूवेट के लिए रूपांतरण के बाद साइट्रिक एसिड चक्र में प्रवेश कर सकते हैं।
बेसल और उत्तेजित शर्तों के दौरान ऊर्जा चयापचय को पोषक तत्वों से विशिष्ट योगदान रेडियोधर्मी ट्रेसर के उपयोग के माध्यम से नजर रखी जा सकती है। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल संस्कृति 12,13 में विकसित कोशिकाओं में ऑक्सीकरण का आकलन करने के लिए इस्तेमाल एक प्रोटोकॉल से ड्रोसोफिला में उपयोग के लिए अनुकूलित है। इस दृष्टिकोण में, फल मक्खियों एक छोटी (घंटे) के लिए आहार में फेड 14 सी-radiolabeled चयापचय substrates (कार्बोहाइड्रेट, फैटी एसिड, या एमिनो एसिड) या लंबे समय (दिन) नाड़ी, लेबल हटाया गया भोजन पर पीछा किया, और फिर एक को उजागर कर रहे हैं चैम्बर बिकारबोनिट के रूप में exhaled सीओ 2 को फँसाने के लिए युक्त पोटेशियम हाइड्रॉक्साइड (KOH) -saturated फिल्टर पेपर। Radiolabeled बिकारबोनिट जगमगाहट गिनती द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। Radiolabeled-सीओ 2 प्रयोग के बीच उत्पादन में मतभेदमक्खियों के अल समूहों जीनोटाइप के बीच ईंधन चयापचय में एक लंबे समय तक तेज या आंतरिक मतभेदों के पाठ्यक्रम पर एटीपी के उत्पादन के लिए विभिन्न ईंधन के प्रयोग, उदाहरण के लिए प्रतिबिंबित कर सकते हैं।
इस प्रोटोकॉल वयस्क ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में विशिष्ट radiolabeled substrates के ऑक्सीकरण को मापने के लिए एक विधि का वर्णन है। इस तकनीक को सरल मात्रात्मक, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और संवेदनशील है, और यह मौजूदा तरीकों कि कुल सीओ 2 उत्पादन और ओ 2 की खपत को मापने क्योंकि यह पोषक तत्व (s) एटीपी के उत्पादन के लिए किया जा रहा ऑक्सीकरण की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का पूरक है।
सीओ 2 का मापन विधि यहाँ वर्णित का उपयोग कर विशिष्ट radiolabeled substrates के ऑक्सीकरण से मुक्त तकनीक है कि कुल सीओ 2 उत्पादन को मापने के लिए पूरक है। कुल सीओ 2 उत्पादन (वी सीओ 2) चयापचय दर के आकलन की अनुमति देता है और, जब कुल हे 2 खपत (वी ओ 2) में जाना जाता है, चयापचय दर की गणना की जा सकती है और ऑक्सीकरण के लिए ईंधन के स्रोत श्वसन विनिमय अनुपात के आधार पर अनुमान लगाया जा सकता है (वि सीओ 2 / वी ओ 2 = RER)। कबकार्बोहाइड्रेट अनन्य सब्सट्रेट, RER = 1 हैं, लेकिन फैटी एसिड अनन्य स्रोत, RER = 0.7, ग्लूकोज और लिपिड ऑक्सीकरण की प्रतिक्रियाओं के stoichiometry के कारण होते हैं। उपकरण ड्रोसोफिला 14 में ऑक्सीजन की खपत को मापने के लिए के अभाव में, ऑक्सीडेटिव ईंधन के स्रोत की पहचान नहीं की जा सकती है। हालांकि, लेबलिंग एक रेडियोधर्मी सब्सट्रेट से या किसी अन्य की मात्रा और radiolabeled सीओ 2 उत्पादन की मापने दरों का पता लगाने के साथ मक्खियों द्वारा, एक निष्कर्ष मक्खियों की क्षमता के लिए एक प्रोत्साहन के दौरान या किसी के प्रभाव के बारे में अलग अलग समय बिंदुओं पर एक दिया सब्सट्रेट oxidize करने के बारे में आकर्षित कर सकते हैं ईंधन ऑक्सीकरण पर उत्परिवर्तन दिया।
इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम के एक नंबर रहे हैं। सबसे पहले, ध्यान जब रेडियोधर्मी सामग्री का उपयोग फैल और अनुसंधान के क्षेत्रों के संक्रमण से बचने के लिए लिया जाना चाहिए। दूसरा, जब कदम 2.1 और 3.4 के दौरान मक्खियों anesthetizing, प्रयोगकर्ता जल्दी से काम करना चाहिए लंबे समय तक सीओ 2 के प्रभाव से बचने के लिएचयापचय और व्यवहार पर जोखिम। 20 मक्खियों के एक समूह anesthetized और एक नई शीशी या 20 सेकंड या उससे कम में एक मक्खी फली में स्थानांतरित किया जा सकता है। जब एक खाद्य शीशी के लिए एक संज्ञाहरण तंत्र से स्थानांतरित, शीशी भोजन सतह पर अटक रही से anesthetized मक्खियों को रोकने के लिए अपने पक्ष पर विश्राम किया जाना चाहिए। मक्खियों 2.2 कदम के रूप में कई दिनों के पाठ्यक्रम पर फेड radiolabeled भोजन कर रहे हैं, प्रयोगकर्ता बीमा होना चाहिए कि खाना बाहर सूखा नहीं है के रूप में मक्खियों निर्जलीकरण के प्रति संवेदनशील हैं।
फेड या उपवास राज्य लेबलिंग करने से पहले, लेबल की पसंद है, लेबलिंग समय की लंबाई, मक्खी फली में समय की लंबाई, और संज्ञाहरण की विधि मानकों को जब इस तकनीक का उपयोग कि समस्या निवारण और संशोधन के लिए किए जा सकते हैं। (- 3 घंटा 2) radiolabeled भोजन के महत्वपूर्ण मात्रा में उपभोग करने के लिए जब तक कि पहले से एक उपवास अवधि के अधीन संभावना नहीं है सबसे पहले, लघु अवधि के लेबलिंग के अधीन मक्खियों। दूसरा, लेबल ग की पसंदएक निष्कर्ष एक चयापचय phenotypes के बारे में आकर्षित करने के लिए सक्षम है प्रभावित करते हैं। उदाहरण के लिए, डी से radiolabeled सीओ 2 उत्पादन [1- 14 सी] -glucose, साइट्रिक एसिड चक्र या pentose फॉस्फेट अलग धकेलना के माध्यम से ऑक्सीकरण प्रतिबिंबित कर सकते हैं, जबकि डी से radiolabeled सीओ 2 उत्पादन [6 14 सी] -glucose ऑक्सीकरण को दर्शाता है साइट्रिक एसिड चक्र के माध्यम से ही 12,15,16। दूध पिलाने की एक radiolabeled दरियाफ्त के साथ मक्खियों एक आवश्यक अमीनो एसिड 17,18 के लिए प्रोटीन से निकाली गई अमीनो एसिड के ऑक्सीकरण का आकलन करने के लिए एक अच्छी रणनीति होगी। अंत में, radiolabeled ग्लूकोज के साथ लंबी अवधि के लेबलिंग भी इस तरह के ट्राइग्लिसराइड्स 19 और ऐसे alanine, जो आसानी से पाइरूवेट साथ interconverts के रूप में अमीनो एसिड के रूप में अणुओं के अन्य वर्गों में इस अग्रदूत को शामिल करने की संभावना बढ़ा। इस अणुओं 6 के इन विभिन्न वर्गों में शामिल रेडियोधर्मिता मापने के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। दरअसल, मक्खियों की अलग साथियों खिलाया जा सकता है रेडएक ही तरीके से substrates iolabeled और फिर उड़ फली प्रयोगों या radiolabel की माप है कि संग्रहीत है और फेड में ग्लाइकोजन और ट्राइग्लिसराइड्स में रहता है और उपवास की स्थिति 6, उदाहरण के लिए के लिए इस्तेमाल किया। एक और रणनीति छोटी-लेबलिंग समय है कि खुद को radiolabeled आहार में पोषक तत्वों की ऑक्सीकरण और इन पोषक तत्वों की नहीं भंडारण रूपों को प्रकट करने की संभावना है का उपयोग है। तीसरा, यह भी संभव है मक्खियों के दो समूहों के 14 से समय की एक निश्चित राशि से अधिक सीओ 2 उत्पादन के समान दरों, लेकिन बहुत अलग दरों शुरू हो सकता है। इसलिए, समय की राशि मक्खी फली में खर्च मक्खियों कि बदलती जब प्ररूपी भिन्नता का आकलन करने को बदलने के लिए एक महत्वपूर्ण पैरामीटर हो सकता है। अंत में, इस प्रोटोकॉल सीओ 2 संज्ञाहरण जब मक्खी फली तंत्र में मक्खियों डालने की एक छोटी अवधि के उपयोग के लिए कहता है। ऐसा नहीं है कि सीओ 2 संज्ञाहरण मक्खी फली प्रयोग के पाठ्यक्रम पर चयापचय समारोह को प्रभावित कर सकता है संभव है। एक वैकल्पिक एकpproach नाइट्रोजन संज्ञाहरण जो चयापचय दर 20 प्रभावित नहीं करता है का उपयोग करने के लिए है।
किसी भी तकनीक है कि ईंधन ऑक्सीकरण और चयापचय दर के रूप में इस तरह के एक जटिल प्रणाली के उपाय के साथ के रूप में, विधि यहाँ वर्णित सीमाएँ हैं। सबसे पहले, यह है कि विभिन्न समूहों radiolabeled भोजन के विभिन्न मात्रा में उपभोग कर सकता है में उड़ता है और इस प्रकार सब्सट्रेट के विभिन्न मात्रा के साथ शुरू परख के सीओ 2 संग्रह चरण में प्रवेश करेगा संभव है। यह बड़ा नमूना आकार के साथ प्रयोग के प्रदर्शन से और सामूहिक रूप से मक्खियों खिलाने से कुछ हद तक नियंत्रित किया जा सकता। लघु अवधि के लिए लेबलिंग, मक्खियों समान नीले रंग का हिम्मत के साथ radiolabel का सेवन किया जाएगा और प्रयोग के लक्ष्य का पीछा हिस्से को आगे बढ़ाया जा सकता है। मक्खियों के एक समूह में शेष radiolabel की राशि भी प्रयोग के अंत में और खिलाने और प्रारंभिक चेस अवधि की समाप्ति के बाद मक्खियों के अलग-अलग साथियों में मापा जा सकता है। दूसरा, के बीच गतिविधि का स्तरमक्खी फली में मक्खियों के समूहों के अलग हो सकता है। इस प्रयोगात्मक निर्धारित है और जब डेटा की व्याख्या ध्यान में रखा जाना पड़ेगा। तीसरा, इस तकनीक की कुल सीओ 2 उत्पादन, केवल एक विशेष आहार पोषक तत्व या कि पोषक तत्व के भंडारण के रूप (एस) से उत्पादन उपाय नहीं है। इस प्रोटोकॉल के लिए एक प्रतिस्थापन नहीं है, लेकिन इसके बजाय VCO 2 की माप के लिए पूरक है, क्योंकि यह अलग है और अतिरिक्त जानकारी प्रदान करता है।
विधि यहाँ वर्णित exhaled, radiolabeled सीओ 2 विशिष्ट चयापचय substrates की मात्रा का पता लगाने के ऑक्सीकरण का एक उत्पाद है कि उपाय। ग्लूकोज, फैटी एसिड, या एमिनो एसिड – – लेबल इस्तेमाल किया अलग करके एक तेजी से परिष्कृत प्रयोगों ऐसे भुखमरी के रूप में और विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि पर अलग-अलग शारीरिक शर्तों के तहत चयापचय के लिए विभिन्न substrates के योगदान का आकलन करने के लिए डिजाइन कर सकते हैं। इस तकनीक का भविष्य अनुप्रयोगों metabolis के माप शामिलविकास के लार्वा और पोटा संबंधी चरणों, ड्रोसोफिला जीवन चक्र है कि पोषक तत्व भंडारण और टूटने, क्रमशः के चरम की विशेषता है की दो चरणों में हूँ।
The authors have nothing to disclose.
The author thanks Drs. Mingjian Lu and Morris Birnbaum for helpful advice and funding support from NIDDK (R21DK089391).
PALMITIC ACID, [1-14C]-, 50 µCi | PerkinElmer | NEC075H050UC | |
GLUCOSE, D-[6-14C]-, 50µCi | PerkinElmer | NEC045X050UC | |
Glucose, D-[1-14C]-, 50µCi | PerkinElmer | NEC043X050UC | |
Drosophila Vials, Narrow, Polystyrene | Genesee Scientific | 32-116 | |
Round-Bottom Polypropylene Tubes, 12X75 mm | Fisher Scientific | 14-959AA | |
Mesh, nitex nylon, 120 µm | Genesee Scientific | 57-102 | |
20ml borosilicate glass scintillation vials | Fisher Scientific | 03-337-15 | |
Flask top stopper with off-center hole | Fisher Scientific | K882310-0000 | |
Polypropylene center well | Fisher Scientific | K882320-0000 | |
Whatman GF/B glass microfiber filter paper, circle, 2.1cm diameter | 09-874-20 | ||
Ecoscint A | National Diagnostics | LS-273 | |
6ml Scintillation Vials with Push-On/Twist-Off Caps | National Diagnostics | SVC-06 |