This paper describes a method for the measurement of fuel oxidation in Drosophila melanogaster in which trace amounts of specific radiolabeled metabolic substrates are fed to flies. The exhaled radiolabeled CO2 that is a produced from fuel oxidation is collected and measured.
초파리 유전학의 힘은 점점 호르몬 신호 전달과 신진 대사의 질문에이 유기체 인간 질병 모델의 개발에 적용되고있다. 이러한 신진 대사 속도와 같은 매개 변수 측정을위한 민감한 방법 등의 과일 파리 같은 작은 동물의 생리 및 질병의 이해를 구동하기 위해 필요하다. 여기에 설명 된 방법은 포도당이나 지방산 등의 14 C 표지 기판 미량 함유 식품을 공급 성인 초파리 소수 연료의 산화를 평가한다. 공급 기간과 추가 실험 조작 후에, 파리, 방사성 CO 2 중탄산 칼륨과 같은 방사성 표지 된 기질의 산화 반응에서 생성 된 후 트랩 호기 KOH 포화 된 여과지를 함유하는 유리 병에 위치 메쉬 캡핑 짧은 튜브로 전송 KHCO 3. 이것은 방사성 중탄산은 섬광 계수에 의해 측정된다. 이 수성이다연료 산화의 연구, uantitative 재현하고 간단한 방법. 방사성 표지 된 글루코스, 지방산, 또는 아미노산의 사용은 공급 금식 같은 다른 유전 적 배경을 다른 조건으로 에너지 대사에 서로 다른 연료 원의 기여의 결정을 허용한다. 이것은 생체 에너지 대사에서 측정하는 데 다른 방법을 보완 및 대사 조절의 이해를 촉진한다.
모델 생물 초파리 melanogaster의에서 작업 유전 원리, 발달 과정, 성장, 노화, 행동, 내성과 인간의 질병 1,2의 이해에 크게 기여하고있다. 초파리의 유전 및 세포 생물학적 접근 방법의 무수한은이 분야에서 발전을 주도하고있다. 그러나, 초파리의 신진 대사의 연구는 더 느리게 개발 등 작은 동물의 신진 대사 매개 변수를 측정의 어려움에 상당 부분 기인하고있다. 당뇨병과 같은 인간의 질병을 연구하는 모델로 초파리를 이용하여과 성장과 다양한 병리에 신진 대사의 기여를 이해에 대한 관심은 개발이 생물 3,4를위한 대사 기술을 적용 할 필드를 밀었다.
신뢰할 수있는 방법은 이제 초파리 대사 매개 변수의 수의 측정에 사용할 수 있습니다. 예를 들면, 식품 섭취를 평가 간단 <s> 5까지 저장 트리글리세리드 글리코겐뿐만 아니라 혈당 수준 체액 순환 글루코스 4 개의 분자로 구성된 이당류 플라이, 트레할로스, 주요 순환 당 수준. 대사 추적자의 사용은 저장 형태의 글리코겐과 중성 지방 6 포도당으로식이 요법과 흡수 된 영양소의 전환에서 영양소 흡수에 대한 연구를 활성화하고있다. 대사율 열매 산소 소비 7,8 이산화탄소 측정 날아 (CO 2) 생산에 평가 될 수있다. 시트르산 회로식이 저장 탄수화물과 지방산의 대사로부터 유도되는 아세틸 코엔자임 A (COA)로서주기를 입력 할 수있는 두 개의 탄소 단위를 산화시킨다. 싸이클마다 한 차례 GTP (또는 ATP)의 각 분자 및 전자 공여체 FADH 2 NADH 세 분자 및 폐 제품이 CO 2 분자를 생성한다. CO 2 생산 수기초 대사 속도를 추정하는데 이용 될 수있다. 총 CO 2 생산은 시판 또는 제 respirometers 9-10,11의 사용을 통해 초파리에서 정량화 할 수있다.
특히 O이 소비의 측정과 결합 된 총 CO 2 생산의 측정은, 전신 에너지 대사에 대한 통찰력을 제공한다. 그러나, 영양을 식별하지 않는이 법안은 아데노신 삼인산 (ATP) 생산을 위해 산화된다. 탄수화물, 지방산, 단백질 : 영양소의 세 가지 주요 클래스는 CoA를 아세틸하는 TCA 회로 다음 변환을 입력 할 수 있습니다. 글루코오스 -6- 포스페이트, 글루코오스 또는식이 저장된 글리코겐으로부터 유도는 아세틸 CoA를 형성하는 피루 베이트 탈수소 효소에 의해 피루브산 탈 카복실되고 변환 될 수있다. 다음 시트르산 회로 입사 아세틸 -CoA ß 산화 수율로식이로부터 또는 저장 트리글리세리드로부터 유도 된 지방산의 고장. 최종적으로아미노산의 대부분은 알파 – 케 토글 루타 레이트 등의 아실 CoA 또는 시트르산 사이클의 중간체 인 아세틸 피루브산으로 변환 후 시트르산 회로를 입력 할 수있다.
기저 및 자극 조건에서 에너지 대사 영양 관련 기여 방사성 트레이서를 사용하여 모니터링 할 수있다. 여기에 제시된 프로토콜 12,13 배양에서 배양 세포에서 산화를 평가하기 위해 사용되는 프로토콜로부터 초파리에서 사용하기 위해 적합하다. 이 방법에서, 초파리는 공급 (14) C-방사성 표지 대사 기판 (탄수화물, 지방산, 또는 아미노산) 짧은 (시간)의 규정 또는 긴 (일) 펄스, 레이블이없는 음식 추격 한 다음에 노출됩니다 챔버 중탄산 호기 CO 2 포집 수산화 칼륨 (KOH) 포화 된 여과지를 포함. 방사성 표지는 중탄산 섬광 계수에 의해 정량화 될 수있다. 실험 사이의 방사성 표지-CO 2 생산의 차이파리 알 기는 예 유전자형 간의 연료 대사 연장 빠르거나 본질적인 차이에 걸쳐 ATP 생산을위한 다른 연료의 사용을 반영 할 수있다.
이 프로토콜은 성인 초파리 특정 방사성 표지 된 기질의 산화를 측정하는 방법을 설명한다. 이 방법은 간단 정량적 재현성 성이며,이 ATP 생산에 산화 영양소 (들)를 식별 할 수 있기 때문에 전체 CO 2 생산 O이 소비를 측정하는 기존의 방법을 보완한다.
여기에 설명 된 방법을 사용하여 특정 방사성 표지 된 기질의 산화로부터 유리 CO 2의 측정은 전체 CO 2 생산을 측정하는 기술을 보완한다. 총 CO 2 제품 (V의 CO2가) 및 총 O 2 소모량 (V O2)가 공지되면, 대사 속도를 산출 할 수 있고, 산화 반응을위한 연료 소스 호흡 교환 비율에 기초하여 추정 될 수있다 (V를 대사량의 평가를 허용 CO2 / V의 O2 = RER). 언제탄수화물 배타적 기판 RER = 1이지만, 지방산은 단독 소스 RER = 0.7, 포도당, 지질의 산화 반응의 화학량 론에 의해이 때. 초파리 (14)의 산소 소비를 측정하는 장치의 부재에있어서, 상기 산화성 연료 소스를 식별 할 수 없다. 라벨이 추적 한 방사성 기판 또는 다른 양 및 방사성 표지 CO 2 생산의 측정 속도로 운항하는 항공사에 의해 그러나, 하나는 자극 동안이나 효과에 대해 서로 다른 시간 지점에서 주어진 기판을 산화하는 파리의 능력에 대한 결론을 도출 할 수 있습니다 연료의 산화에 돌연변이를 부여.
이 프로토콜에서 중요한 단계가 있습니다. 유출 및 연구 분야의 오염을 방지하기 위해, 방사성 물질을 사용할 때는 먼저주의를 기울여야한다. 단계 2.1 및 3.4 중 파리 마취 둘째, 실험자 장시간 CO (2)의 효과를 피하기 위하여 신속하게 작동해야신진 대사와 행동에 노출. 20 파리의 그룹 마취 새로운 바이알에 20 초 이하에서 비행 포드로 전송할 수 있습니다. 식품 유리 병에 마취 장치에서 전송하면, 유리 병은 음식 표면에 갇히지에서 마취 파리를 방지하기 위해 옆에 휴식해야한다. 파리 단계 2.2에서와 같이 여러 날에 걸쳐 공급 방사성 표지 음식 경우, 실험자는 파리 탈수에 민감로 음식이 건조하지 않도록 보장해야한다.
연방 또는 금식 상태 사전 라벨링 라벨의 선택, 표시 시간의 길이, 플라이 포드 기간, 마취의 방법은이 방법을 사용할 때, 문제 및 변형을 실시 할 수있는 파라미터이다. (- 3 시간 2) 사전에 금식 기간을 실시하지 않는 방사성 표지 음식의 상당량을 소비 할 가능성이 첫째, 짧은 라벨링 기간을 실시 날아갑니다. 라벨 C 둘째, 검색한 대사 표현형에 대한 이끌어 낼 수있는 결론에 영향을 미칩니다. 예를 들어, D-에서 방사성 표지 CO 2 생산 [1- (14) C] 글루코스는 시트르산 사이클 또는 펜 토스 포스페이트 션트 통해 산화를 반영 할 수는 D-에서 방사성 CO 2 생산 반면 [6- (14) C] 글루코스 산화 반영 시트르산 회로 통해서만 12,15,16. 필수 아미노산 (17, 18)에 대한 방사성 트레이서 파리 먹이는 것은 단백질 유래의 아미노산의 산화를 평가하는 좋은 전략이 될 것이다. 마지막으로, 방사성 표지 포도당과 긴 표시 기간은 또한 중성 지방 (19)와 같은 쉽게 피루브산과 interconverts 알라닌 등의 아미노산과 같은 분자의 다른 클래스에이 전구 물질의 혼입의 가능성을 올립니다. 이것은 분자 (6)의 서로 다른 클래스에 혼입 된 방사능을 측정함으로써 평가 될 수있다. 사실, 파리의 별도의 동료가 공급 될 수 방사선동일한 방식으로 기판 iolabeled하고, 예를 들면 조건 (6)에 저장된 공급 글리코겐 및 트리글리세리드 유지 금식된다 플라이 포드 실험 또는 방사능 표지의 측정에 사용된다. 또 다른 전략은 방사성 표지식이 영양소 자체 산화 이들 영양소 저장되지 형태 공개 가능성 단락 표시 기간을 사용하는 것이다. 셋째, 파리의 두 그룹이 처음 주어진 시간에 걸쳐 14 CO 2 생산의 동일 등급하지만, 매우 상이한 레이트를 가질 수 있다는 것도 가능하다. 따라서, 플라이 창에 지출 파리 시간의 양을 변화하면 표현형의 변화를 평가할 때 변경하는 중요한 매개 변수 일 수있다. 마지막으로,이 프로토콜은 CO 2 마취 플라이 포드 장치에 파리를 넣어 짧은 기간의 사용을 요구한다. CO 2 마취 플라이 포드 실험의 과정을 통해 대사 기능에 영향을 미칠 수있다. 또 다른 a를pproach은 신진 대사 속도 (20)에 영향을주지 않습니다 질소 마취를 사용하는 것입니다.
연료의 산화 및 신진 대사 속도와 같은 복잡한 시스템을 측정하는 기술과 마찬가지로, 여기에 설명 된 방법은 한계가있다. 첫째, 기판의 다른 시작 양 분석의 CO 2 컬렉션 위상을 입력 따라서 방사성 음식의 다른 양을 소비 할 수있는 다른 그룹에 날아 것이 가능하다. 이것은 큰 샘플 크기의 실험을 수행함으로써 한꺼번에 파리를 공급함으로써 어느 정도에 대해 제어 될 수있다. 비슷한 푸른 색 용기는 방사성 표지를 소비 한 것이며 실험의 추적 부분에 이월 할 수와 짧은 라벨 기간 동안, 파리. 파리의 그룹에 남아있는 방사성 표지의 양을 또한 실험의 끝에서 상기 공급 및 초기 추적 기간 종료 후 파리 별도 코호트를 측정 할 수있다. 사이 둘째, 활동 수준파리 포드에서 파리의 그룹이 다를 수 있습니다. 이는 실험적으로 결정된 데이터를 해석 할 때 고려되어야 할 것이다. 셋째로,이 기술은 전체 CO 2 생산 특정한식이 영양제 또는 영양소의 저장 형태 (들) 만 생산을 측정하지 않는다. 이 프로토콜은 대체하지 않습니다하지만 다른 및 추가 정보를 제공하기 때문에 대신 VCO (2)의 측정을 보완.
여기에 기재된 방법은 특정 대사 기질 미량의 산화 반응의 산물이며, 방사성 CO 2 호기 측정한다. 포도당 지방산 또는 아미노산 – – 사용 된 상표를 변화시킴으로써 하나는 기아 같은 다른 유전 적 배경에 다른 생리 학적 조건하에 대사 상이한 기판들의 기여를 평가하기 위해 더욱 정교한 실험을 설계 할 수있다. 이 기술의 미래 응용 프로그램은 metabolis의 측정을 포함개발의 애벌레와 번데기 단계, 각각 영양소 저장 및 고장의 극단을 특징으로 초파리의 수명주기의 두 단계에서 m.
The authors have nothing to disclose.
The author thanks Drs. Mingjian Lu and Morris Birnbaum for helpful advice and funding support from NIDDK (R21DK089391).
PALMITIC ACID, [1-14C]-, 50 µCi | PerkinElmer | NEC075H050UC | |
GLUCOSE, D-[6-14C]-, 50µCi | PerkinElmer | NEC045X050UC | |
Glucose, D-[1-14C]-, 50µCi | PerkinElmer | NEC043X050UC | |
Drosophila Vials, Narrow, Polystyrene | Genesee Scientific | 32-116 | |
Round-Bottom Polypropylene Tubes, 12X75 mm | Fisher Scientific | 14-959AA | |
Mesh, nitex nylon, 120 µm | Genesee Scientific | 57-102 | |
20ml borosilicate glass scintillation vials | Fisher Scientific | 03-337-15 | |
Flask top stopper with off-center hole | Fisher Scientific | K882310-0000 | |
Polypropylene center well | Fisher Scientific | K882320-0000 | |
Whatman GF/B glass microfiber filter paper, circle, 2.1cm diameter | 09-874-20 | ||
Ecoscint A | National Diagnostics | LS-273 | |
6ml Scintillation Vials with Push-On/Twist-Off Caps | National Diagnostics | SVC-06 |