Design og Udvikling af aptamer-Gold Nanopartikel kolorimetrisk Analyser for In-the-field Applications
Summary
Designet og udviklingen af en aptamer-guld nanopartikel kolorimetrisk assay til påvisning af små molekyler for in-the-field ansøgninger blev undersøgt. Endvidere blev en smart-enhed kolorimetrisk applikation (app) valideret og langtidsopbevaring af assayet blev etableret til anvendelse i marken.
Abstract
Design og udvikling af en aptamer-guld nanopartikler (AUNP) kolorimetrisk analyse til påvisning af små molekyler for in-the-field applikationer blev undersøgt. Target selektiv AUNP baseret farve assays er blevet udviklet i kontrollerede proof-of-concept laboratoriet indstillinger. Men disse ordninger ikke er blevet udøvet, til et punkt for fiasko til at bestemme deres praktiske anvendelse ud over laboratoriet indstillinger. Dette arbejde beskriver en generisk tilgang til design, udvikling og fejlfinding en aptamer-AUNP kolorimetrisk analyse for små molekyler analytter og bruge analysen for in-the-field-indstillinger. Analysen er fordelagtig, fordi adsorberede aptamerer passivere nanopartikler overflader og giver et middel til at reducere og eliminere falsk positive reaktioner på uden for målgruppen analytter. Overgang dette system til praktiske anvendelser kræves definerer ikke kun holdbarheden af aptamer-AUNP assay, men oprettelse metoder og procedurer for at udvide langtidsopbevaring capabilteter. Også en af de anerkendte bekymringer med kolorimetrisk udlæsning er byrden placeret på analytikere til at præcist at identificere ofte subtile ændringer i farve. For at mindske den ansvar analytikere på området, blev en farve analyse protokol designet til at udføre de identifikationsnumre farve opgaver uden behov for at udføre denne opgave på laboratoriekvalitet udstyr. Fremgangsmåden til at skabe og afprøve dataanalysen protokol er beskrevet. Men for at forstå og påvirke udformningen af adsorberede aptamer analyser, samspillet associeret med aptamer, mål, og AuNPs kræver yderligere undersøgelse. Den opnåede viden kan føre til skræddersy aptamerer for forbedret funktionalitet.
Introduction
Kolorimetri er en af de ældste teknikker, der anvendes i analytisk kemi. Til denne teknik, er en kvalitativ eller kvantitativ bestemmelse af analysanden gjort baseret på produktion af en farvet forbindelse en. Typisk farve analyser anvender reagenser, der oplever en farveskift i nærværelse af analyt arter, hvilket resulterer i en observerbar eller detekterbar farveændring i det synlige lysspektrum. Kolorimetri er blevet anvendt i påvisningen af mål spænder fra atomer, ioner og små molekyler til komplekse biologiske molekyler, såsom deoxyribonukleinsyrer (DNA), peptider og proteiner 2-4. I de sidste to årtier har nanomaterialer revolutioneret området påvisningsassays, især med farve baserede assays 5-6. Ved at kombinere de unikke kemiske og fysiske egenskaber af nanomaterialer med et mål selektiv anerkendelse element, såsom antistoffer, oligonukleotid aptamerer eller peptidaptamerer, har ført til genopblussen in design og udvikling af kolorimetriske detektionsassays 7.
Metalnanopartikler har en påvist størrelse-afhængig farveændring ejendom, som er blevet udnyttet i designet af mange kolorimetriske assays. Guld nanopartikler (AuNPs) er af særlig interesse på grund af en karakteristisk rød-til-blå farveskift, når den dispergerede opløsning af partikler induceres til at aggregere 8, typisk gennem den præcise tilsætning af salt. Evnen til at styre overgangen fra den spredte (rød) til de aggregerede (blå) stater har ført til oprettelsen af kolorimetriske sensorer til ioniske, små molekylære, peptid, protein og cellulære mål 2-4,9. Mange af disse sensorer anvender aptamerer som mål genkendelsesmotiv.
Aptamerer er DNA eller ribonukleinsyre (RNA) -molekyler valgt blandt en tilfældig pulje på 10 12 -10 15 forskellige sekvenser 10-11. Udvælgelsesprocessen identificerer mål rekognition elementer med bindingsaffiniteter i det lave nanomolære styre og systematisk udvikling af ligander ved eksponentiel berigelse (SELEX) er den mest almindeligt kendte fremgangsmåde 12-13. Fordele ved oligonucleotid baserede aptamerer til sensing applikationer omfatter nem syntese, kontrollerbar kemisk modifikation, og kemisk stabilitet 14-15.
En metode til at skabe en kolorimetrisk assay kombinerer nanomaterialer med elementer anerkendelse, består af at kombinere disse to arter gennem den fysiske adsorption af DNA-aptamer molekyler til AUNP overflader. Gennem target-aptamer binding, aptameren oplever en strukturel ændring 16-18, der ændrer interaktionen af aptameren med AUNP overflade, hvilket fører til en inducerbar rød-til-blå farve respons 19 med tilføjelse af salt. Denne overraskende træk ved AuNPs giver en observerbar kolorimetrisk reaktion mekanisme til aptamer-baserede enheder, der kan bruges til at delog kolorimetriske assays for forskellige analytter.
Color analyser udformet ved hjælp af ikke-kovalente, fysisk adsorberede DNA aptamerer på AUNP overflader har den stigmatisering af at være en svag sensor platform på grund af problemer med robusthed, en tilbøjelighed til fiasko uden for kontrollerede laboratorieforhold indstillinger, og de manglende oplysninger til rådighed til brug i det praktiske indstillinger. Men aptamer-AUNP baseret kolorimetrisk analyse var, af interesse på grund af enkelheden i drift og observerbar farve respons. Målet med dette arbejde er at give en protokol for design, udvikling, drift, reduktion af overfladen relateret falsk positivt svar, og langtidsopbevaring af DNA-AUNP baserede kolorimetriske assays bruger kokain som repræsentant analyt. Desuden foreslog vi denne adsorberet aptamer assay tilgang (figur 1) som værende en fordel på grund af enkelhed og brugervenlighed, der resulterede i færre trin end den konventionelle tilgang til disse aptamer-AUNP røvays. Til dette assay blev aptameren først tilsat til AuNPs, der fik lov til at adsorbere til overfladen i en længere periode. En yderligere fordel ved denne fremgangsmåde var reduktionen af respons på ikke-target analytmolekyler relateret til AUNP overfladeinteraktioner. Men reduktionen i falsk positiv reaktion var på bekostning af analysesensitivitet. Derfor en balance mellem beskyttelse overflade og analyt tilgængelighed er nødvendig for at opretholde en ordentlig analyse funktion. Desuden er en stor mangel, at analysere farve analyser på anden måde end med instrumentering er, at resultaterne ofte er subjektive og åbne for fortolkning fra analytiker-til-analytiker, især når de forsøger at skelne subtile forskelle i farve. Omvendt er der en række problemer med at gøre laboratorium baseret instrumentering anvendelig uden for laboratoriet, såsom tilgængelighed af el, funktionalitet med portabilitet, etc. I dette arbejde blev en farve analyse protokol udviklet til more portabilitet og at eliminere nogle af de gætterier ofte forbundet med farve baseret assay fortolkning 20-21. I forhold til tidligere metoder, denne indsats bestræbt sig på at skubbe disse analyser til deres grænser for applikationer uden laboratoriet indstillinger.
Protocol
Representative Results
Discussion
I det seneste årti har nanopartikler baseret kolorimetriske assays blevet udviklet til påvisning af mål indbefatter små molekyler, DNA, proteiner og celler 2-4. Analyser, der bruger DNA-aptamere med nanopartikler har vundet interesse. Typisk er disse kolorimetriske assays udføres ved at blande DNA-aptamer med analytmolekyler efterfulgt af tilsætning til AuNPs 9-10. Disse analyser er blevet brugt i proof-of-concept demonstrationer med kontrollerede laboratoriet indstillinger og med begrænsede…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partially funded by the Air Force Office of Scientific Research and the Assistant Secretary of Defense for Research and Engineering (Defense Biometrics and Forensics Office). JES participation was supported by a National Research Council Research Associateship Award at Air Force Research Laboratory.
Materials
| Gold(III) chloride hydrate | Sigma | 254169 | 99.999% purity is important and solutions were made fresh every time |
| Sodium Citrate Dihydrate | Sigma | W302600-1KG-K | We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and solutions were made fresh every time |
| Synergy | Bio-TEK | HT | Any absorbance spectrometer will work, but a platereader provides multiple sample analysis |
| 4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) Buffer, 1 M sterilized | Amresco | J848 | Any sterilized brand will work |
| Corning, 250 mL Filter System, 0.22 µm cellulose acetate | Fisher | 430767 | Other membranes have been found to remove the AuNPs |
| UV Spectrophophotometer | Varian | Cary 300 | Any absorbance spectrometer will work |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fluka | 63068 | ≥98% any brand will work |
| DNA | IDT | Custom | DNA was purified with a desalting column, higher purification techniques can be used |
| Procaine Hydrochloride | ACROS | AC20731-1000 | 99% stocks of 1 mg/mL in methanol were prepared |
| Hydrochloric Acid | Fisher | A144S-500 | 36.5-38.0% w/w other brands will work |
| Cocaine Hydrochloride | Lipomed | COC-156-HC-1LM | We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays |
| Nitric Acid | Fisher | A509-SK212 | 65% w/w other brands will work |
| Sodium Chloride Solution, 5 M bioreagent grade | Sigma | S5150-1L | Sterile solutions made from solid will work |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | D5758-25 mL | ≥97% any brand will work |
| Ecgoninemethylester Hydrochloride | Lipomed | COC-205-HC-1LM | We obtained the EME control from the same manufacturer as the cocaine target |
| Microcentrifuge Tubes, Axygen Scientific, nonsterile, 1.7mL | VWR | 10011-722 | We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and the tubes were autoclaved in house |
| nuclease free water | |||
| methanol |
References
- Housecroft, C., Constable, E. . Chemistry: an introduction to organic, inorganic, and physical chemistry. , 349-353 (2006).
- Bunka, D., Stockley, P. Aptamers come of age-at last. Nat. Rev. Microbiol. 4 (8), 588-596 (2006).
- Mayer, G. The chemical biology of aptamers. Angew. Chem. 48 (15), 2672-2689 (2009).
- Medley, C., Smith, J., Tang, Z., Wu, Y., Bamrungsap, S., Tan, W. Gold Nanoparticle-Based Colorimetric Assay for the Direct Detection of Cancerous Cells. Anal. Chem. 80 (4), 1067-1072 (2008).
- Giljohann, D., Seferos, D., Daniel, W., Massich, M., Patel, P., Mirkin, C. Gold nanoparticles for biology and medicine. Angew. Chem. Int. Ed. 49 (19), 3280-3294 (2010).
- Iliuk, A., Hu, L., Tao, W. Aptamer in bioanalytical applications. Anal. Chem. 83 (12), 4440-4452 (2011).
- Smith, J., Griffin, D., Leny, J., Hagen, J., Chávez, J., Kelley-Loughnane, N. Colorimetric detection with aptamer-gold nanoparticle conjugates coupled to an android-based color analysis application for use in the field. Talanta. 121, 247-255 (2014).
- Alivasatos, A., et al. Organization of nanocrustal molecules using DNA. Nature. 382, 609-611 (1996).
- Wang, L., Liu, X., Song, S., Fan, C. Unmodified gold nanoparticles as a colorimetric probe for potassium DNA aptamers. Chem. Commun. (36), 3780-3782 (2006).
- Liu, J., Lu, Y. Fast colorimetric sensing of adenosine and cocaine based on a general sensor design involving aptamers and nanoparticles. Angew. Chem. 118 (1), 96-100 (2006).
- Pavlov, V., Xiao, Y., Shlyahovsky, B., Willner, I. Aptamer-functionalized Au nanoparticles for the amplified optical detection of thrombin. J. Am. Chem. Soc. 126 (38), 11768-11769 (2004).
- Mayer, G. The chemical biology of aptamers. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (15), 2672-2689 (2009).
- Hermann, T., Patel, D. Adaptive recognition by nucleic acid aptamers. Science. 287 (5454), 820-825 (2000).
- Lee, J., Stovall, G., Ellington, A. Aptamer therapeutics advance. Curr. Opin. Chem. Biol. 10 (3), 282-289 (2006).
- Song, S., Wang, L., Li, J., Zhao, J., Fan, C. Aptamer-based biosensors. TrAC. 27 (2), 108-117 (2008).
- Wei, H., Li, B., Wang, E., Dong, S. Simple and sensitive aptamer-based colorimetric sensing of protein using unmodified gold nanoparticles. Chem. Commun. (36), 3735-3737 (2007).
- Zheng, Y., Wang, Y., Yang, X. Aptamer-based colorimetric biosensing of dopamine using unmodified gold nanoparticles. Sensors and Actuators B. 156 (1), 95-99 (2011).
- Chávez, J., MacCuspie, R., Stone, M., Kelley-Loughnane, N. Colorimetric detection with aptamer-gold nanoparticle conjugates: effect of aptamer length on response. J. Nanopart. Res. 14 (10), 1-11 (2012).
- Neves, M., Reinstein, O., Johnson, P. Defining a stem length-dependent binding mechanism for the cocaine-binding aptamer. A combined NMR and calorimetry study. Biochimie. 49 (39), 8478-8487 (2010).
- Li, H., Rothberg, L. Label-Free Colorimetric Detection of Specific Sequences in Genomic DNA Amplified by the Polymerase Chain Reaction. J. Am. Chem. Soc. 126 (35), 10958-10961 (2004).
- Li, H., Rothberg, L. Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles. Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (39), 14036-14039 (2004).
- Smith, J., Medley, C., Tang, Z., Shangguan, D., Lofton, C., Tan, W. Aptamer-Conjugated Nanoparticle for the Collection and Detection of Multiple Cancer Cells. Anal. Chem. 79 (8), 3075-3082 (2007).
- Martin, J., Chávez, J., Chushak, Y., Chapleau, R., Hagen, J., Kelley-Loughnane, N. Tunable stringency aptamer selection and gold nanoparticle assay for detection of cortisol. Anal. Bioanal. Chem. 406 (19), 4637-4647 (2014).
- Shen, L., Hagen, J., Papautsky, I. Point-of-care colorimetric detection with a smartphone. Lab on a Chip. 12 (21), 4240-4243 (2012).
- Choodum, A., Kanatharana, P., Wongniramaikul, W., NicDaeid, N. Rapid quantitative colourimetric tests for trinitrotoluene (TNT) in soil. Forensic. Sci. Int. 222 (1), 340-345 (2012).
