Design and Development van aptameer-gouden nanodeeltjes gebaseerde Colorimetrisch Testen voor In-the-field Applications
Summary
Het ontwerpen en ontwikkelen van een aptameer-gouden nanodeeltjes colorimetrische assay voor de detectie van kleine moleculen in-het-veld toepassingen onderzocht. Bovendien, een smart-inrichting colorimetrische applicatie (app) werd gevalideerd en langdurige opslag van de test werd voor gebruik in het veld.
Abstract
Het ontwerp en de ontwikkeling van een aptameer-gouden nanodeeltjes (AuNP) colorimetrische test voor de detectie van kleine moleculen voor in-het-veld toepassingen onderzocht. Target selectieve AuNP gebaseerd kleur testen zijn ontwikkeld in gecontroleerde laboratorium instellingen proof-of-concept. Echter, deze regelingen niet zijn uitgeoefend om een point of failure om hun praktisch gebruik buiten het laboratorium instellingen bepalen. Dit werk beschrijft een generieke aanpak voor het ontwerpen, ontwikkelen, en het oplossen van een aptameer-AuNP colorimetrische assay voor kleine moleculen te analyseren stoffen en het gebruik van de test voor in-het-veld instellingen. De test is voordelig omdat geadsorbeerd aptameren passiveren de nanodeeltjes oppervlakken en een middel te verminderen en te elimineren vals positieve reacties op niet-doelanalyten. Overstappen dit systeem om praktische toepassingen vereist het definiëren van niet alleen de houdbaarheid van de aptameer-AuNP assay, maar vaststelling van methoden en procedures voor de uitbreiding van de opslag op lange termijn capabilteiten. Ook een van de erkende problemen met colorimetrische uitlezing is de belasting van analisten vaak subtiele veranderingen in kleur nauwkeurig te identificeren. De verantwoordelijkheid analisten in het veld te verminderen, werd een kleuranalyse protocol ontworpen om de kleuridentificatie taak zonder de noodzaak van het uitvoeren van deze taak laboratoriumkwaliteit apparatuur. De werkwijze voor het maken en testen van de gegevensanalyse protocol wordt beschreven. Echter begrijpen of de opzet van geadsorbeerde aptameer assays, de interacties geassocieerd met de aptameer, doel en AuNPs verder bestudeerd. De opgedane kennis kan leiden tot op maat aptameren voor een verbeterde functionaliteit.
Introduction
Colorimetrie is een van de oudste technieken van analytische chemie. Voor deze techniek wordt een kwalitatieve of kwantitatieve bepaling van de analyt gemaakt op basis van de productie van een gekleurde verbinding 1. Gewoonlijk kleur assays reagentia die een kleurverschuiving in aanwezigheid van het analyt species, waardoor een waarneembare of waarneembare kleurverandering in het zichtbare lichtspectrum ervaren. Colorimetrie is gebruikt bij de detectie van targets variërend van atomen, ionen en kleine moleculen tot complexe biologische moleculen zoals deoxyribonucleïnezuren (DNA), peptiden en eiwitten 2-4. In de afgelopen twee decennia nanomaterialen de detectiehoek assays revolutie, met name kleur gebaseerde testen 5-6. Het combineren van de unieke chemische en fysische eigenschappen van nanomaterialen met een element doelwit selectieve herkenning, zoals antilichamen, aptameren oligonucleotide of peptide aptameren, heeft geleid tot de opleving in het ontwerpen en ontwikkelen van colorimetrische detectie assays 7.
Metaal nanodeeltjes een grootte aangetoond afhankelijke kleurverandering eigenschap, die benut is bij het ontwerpen van talrijke colorimetrische assays. Gouden nanodeeltjes (AuNPs) zijn van bijzonder belang als gevolg van een distinctief rood naar blauw kleurverschuiving, wanneer de gedispergeerde oplossing deeltjes geïnduceerd om te aggregeren 8, kenmerkend door nauwkeurige toevoeging van zout. De mogelijkheid om de overgang van de verspreide (rood) controleren om de geaggregeerde (blauw) staten heeft geleid tot de oprichting van colorimetrische sensoren voor ionische, kleine moleculaire, peptide, eiwit en cellulaire doelwitten 2-4,9. Veel van deze sensoren gebruiken aptameren als motief beeldherkenning.
Aptameren zijn DNA of ribonucleïnezuur (RNA) moleculen gekozen uit een willekeurige verzameling van 10 12 -10 15 verschillende sequenties 10-11. Het selectieproces identificeert doel recognitie elementen bindingsaffiniteiten in het lage nanomolaire regime, en de systematische ontwikkeling van liganden door exponentiële verrijking (SELEX) is de meest bekende werkwijze 12-13. Voordelen van de oligonucleotide gebaseerd aptameren voor sensing toepassingen zijn onder meer het gemak van de synthese, controleerbare chemische modificatie, en chemische stabiliteit 14-15.
Een benadering voor het creëren van een colorimetrische assay combineert met nanomaterialen herkenningselementen, bestaat uit deze twee soorten combineren door fysische adsorptie van DNA-moleculen aan aptameer AuNP oppervlakken. Door target-bindende aptameer, de aptameer ervaart een structurele verandering 16-18 dat de interactie van de aptameer met de AuNP oppervlak, wat leidt tot een induceerbare rood naar blauw kleurrespons 19 met de toevoeging van zout verandert. Deze verbazingwekkende eigenschap van AuNPs biedt een waarneembare colorimetrische reactiemechanisme voor aptameergebaseerde apparaten die kunnen worden gebruikt om even teteken colorimetrische assays voor verschillende analyten.
Kleur assays ontworpen met behulp van niet-covalente, fysisch geadsorbeerd DNA aptameren op AuNP oppervlakken hebben het stigma van een zwakke sensor platform te wijten aan problemen met robuustheid, een neiging voor het niet buiten de gecontroleerde laboratorium instellingen, en het gebrek aan informatie beschikbaar voor gebruik in de praktijk instellingen. Echter, de aptameer-AuNP gebaseerde colorimetrische bepaling was in de belangstelling vanwege de eenvoud van bediening en waarneembare kleur reactie. Het doel van dit werk is om een protocol voor het ontwerp, de ontwikkeling, de exploitatie, de vermindering van de oppervlakte gerelateerde vals positieve reactie, en langdurige opslag van DNA-AuNP gebaseerde colorimetrische assays het gebruik van cocaïne als de vertegenwoordiger te analyseren. Verder stelden we deze geadsorbeerde aptameer assay benadering (figuur 1) als voordelig vanwege eenvoud en gebruiksgemak die resulteerde in minder stappen dan de conventionele benadering voor deze aptameer-AuNP assegen. Voor deze test werd de aptameer eerst toegevoegd aan de AuNPs, die mochten adsorberen aan het oppervlak voor langere tijd. Een bijkomend voordeel van deze aanpak is de verlaging van de respons op niet-doelanalyt moleculen soortgelijk aan AuNP oppervlakte interacties. De vermindering van vals positieve reactie ten koste van assaygevoeligheid. Dus een evenwicht tussen oppervlaktebescherming en analyt toegankelijkheid moet goede test blijft werken. Bovendien is een belangrijk gebrek analyseren kleur assays met andere middelen dan met instrumentatie die de resultaten vaak subjectief en voor interpretatie van analist tot analist, vooral wanneer het proberen om subtiele verschillen in kleur onderscheiden. Omgekeerd zijn er een aantal problemen met het maken van laboratorium op basis van instrumentatie bruikbaar buiten het laboratorium, zoals de beschikbaarheid van de macht, zakelijkheid met draagbaarheid, enz. In dit werk werd een kleuranalyse protocol ontwikkeld voor more draagbaarheid en om een deel van het giswerk vaak geassocieerd met kleur gebaseerde test interpretatie 20-21 te elimineren. In vergelijking met eerdere benaderingen die inspanning naar gestreefd om deze assays bewegen hun grenzen voor toepassingen buiten het laboratorium instellingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In het afgelopen decennium, hebben nanodeeltjes gebaseerde colorimetrische assays ontwikkeld voor de detectie van doelen omvatten kleine moleculen, DNA, eiwitten en cellen 2-4. Testen die DNA-aptameren te gebruiken met nanodeeltjes hebben gewonnen belang. Meestal worden deze colorimetrische assays uitgevoerd door het mengen van de DNA-aptameer met analysemonstermoleculen gevolgd door toevoeging aan AuNPs 9-10. Echter, deze tests zijn gebruikt in proof-of-concept demonstraties met een gecontroleerde…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partially funded by the Air Force Office of Scientific Research and the Assistant Secretary of Defense for Research and Engineering (Defense Biometrics and Forensics Office). JES participation was supported by a National Research Council Research Associateship Award at Air Force Research Laboratory.
Materials
| Gold(III) chloride hydrate | Sigma | 254169 | 99.999% purity is important and solutions were made fresh every time |
| Sodium Citrate Dihydrate | Sigma | W302600-1KG-K | We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and solutions were made fresh every time |
| Synergy | Bio-TEK | HT | Any absorbance spectrometer will work, but a platereader provides multiple sample analysis |
| 4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) Buffer, 1 M sterilized | Amresco | J848 | Any sterilized brand will work |
| Corning, 250 mL Filter System, 0.22 µm cellulose acetate | Fisher | 430767 | Other membranes have been found to remove the AuNPs |
| UV Spectrophophotometer | Varian | Cary 300 | Any absorbance spectrometer will work |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fluka | 63068 | ≥98% any brand will work |
| DNA | IDT | Custom | DNA was purified with a desalting column, higher purification techniques can be used |
| Procaine Hydrochloride | ACROS | AC20731-1000 | 99% stocks of 1 mg/mL in methanol were prepared |
| Hydrochloric Acid | Fisher | A144S-500 | 36.5-38.0% w/w other brands will work |
| Cocaine Hydrochloride | Lipomed | COC-156-HC-1LM | We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays |
| Nitric Acid | Fisher | A509-SK212 | 65% w/w other brands will work |
| Sodium Chloride Solution, 5 M bioreagent grade | Sigma | S5150-1L | Sterile solutions made from solid will work |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | D5758-25 mL | ≥97% any brand will work |
| Ecgoninemethylester Hydrochloride | Lipomed | COC-205-HC-1LM | We obtained the EME control from the same manufacturer as the cocaine target |
| Microcentrifuge Tubes, Axygen Scientific, nonsterile, 1.7mL | VWR | 10011-722 | We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and the tubes were autoclaved in house |
| nuclease free water | |||
| methanol |
References
- Housecroft, C., Constable, E. . Chemistry: an introduction to organic, inorganic, and physical chemistry. , 349-353 (2006).
- Bunka, D., Stockley, P. Aptamers come of age-at last. Nat. Rev. Microbiol. 4 (8), 588-596 (2006).
- Mayer, G. The chemical biology of aptamers. Angew. Chem. 48 (15), 2672-2689 (2009).
- Medley, C., Smith, J., Tang, Z., Wu, Y., Bamrungsap, S., Tan, W. Gold Nanoparticle-Based Colorimetric Assay for the Direct Detection of Cancerous Cells. Anal. Chem. 80 (4), 1067-1072 (2008).
- Giljohann, D., Seferos, D., Daniel, W., Massich, M., Patel, P., Mirkin, C. Gold nanoparticles for biology and medicine. Angew. Chem. Int. Ed. 49 (19), 3280-3294 (2010).
- Iliuk, A., Hu, L., Tao, W. Aptamer in bioanalytical applications. Anal. Chem. 83 (12), 4440-4452 (2011).
- Smith, J., Griffin, D., Leny, J., Hagen, J., Chávez, J., Kelley-Loughnane, N. Colorimetric detection with aptamer-gold nanoparticle conjugates coupled to an android-based color analysis application for use in the field. Talanta. 121, 247-255 (2014).
- Alivasatos, A., et al. Organization of nanocrustal molecules using DNA. Nature. 382, 609-611 (1996).
- Wang, L., Liu, X., Song, S., Fan, C. Unmodified gold nanoparticles as a colorimetric probe for potassium DNA aptamers. Chem. Commun. (36), 3780-3782 (2006).
- Liu, J., Lu, Y. Fast colorimetric sensing of adenosine and cocaine based on a general sensor design involving aptamers and nanoparticles. Angew. Chem. 118 (1), 96-100 (2006).
- Pavlov, V., Xiao, Y., Shlyahovsky, B., Willner, I. Aptamer-functionalized Au nanoparticles for the amplified optical detection of thrombin. J. Am. Chem. Soc. 126 (38), 11768-11769 (2004).
- Mayer, G. The chemical biology of aptamers. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (15), 2672-2689 (2009).
- Hermann, T., Patel, D. Adaptive recognition by nucleic acid aptamers. Science. 287 (5454), 820-825 (2000).
- Lee, J., Stovall, G., Ellington, A. Aptamer therapeutics advance. Curr. Opin. Chem. Biol. 10 (3), 282-289 (2006).
- Song, S., Wang, L., Li, J., Zhao, J., Fan, C. Aptamer-based biosensors. TrAC. 27 (2), 108-117 (2008).
- Wei, H., Li, B., Wang, E., Dong, S. Simple and sensitive aptamer-based colorimetric sensing of protein using unmodified gold nanoparticles. Chem. Commun. (36), 3735-3737 (2007).
- Zheng, Y., Wang, Y., Yang, X. Aptamer-based colorimetric biosensing of dopamine using unmodified gold nanoparticles. Sensors and Actuators B. 156 (1), 95-99 (2011).
- Chávez, J., MacCuspie, R., Stone, M., Kelley-Loughnane, N. Colorimetric detection with aptamer-gold nanoparticle conjugates: effect of aptamer length on response. J. Nanopart. Res. 14 (10), 1-11 (2012).
- Neves, M., Reinstein, O., Johnson, P. Defining a stem length-dependent binding mechanism for the cocaine-binding aptamer. A combined NMR and calorimetry study. Biochimie. 49 (39), 8478-8487 (2010).
- Li, H., Rothberg, L. Label-Free Colorimetric Detection of Specific Sequences in Genomic DNA Amplified by the Polymerase Chain Reaction. J. Am. Chem. Soc. 126 (35), 10958-10961 (2004).
- Li, H., Rothberg, L. Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles. Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (39), 14036-14039 (2004).
- Smith, J., Medley, C., Tang, Z., Shangguan, D., Lofton, C., Tan, W. Aptamer-Conjugated Nanoparticle for the Collection and Detection of Multiple Cancer Cells. Anal. Chem. 79 (8), 3075-3082 (2007).
- Martin, J., Chávez, J., Chushak, Y., Chapleau, R., Hagen, J., Kelley-Loughnane, N. Tunable stringency aptamer selection and gold nanoparticle assay for detection of cortisol. Anal. Bioanal. Chem. 406 (19), 4637-4647 (2014).
- Shen, L., Hagen, J., Papautsky, I. Point-of-care colorimetric detection with a smartphone. Lab on a Chip. 12 (21), 4240-4243 (2012).
- Choodum, A., Kanatharana, P., Wongniramaikul, W., NicDaeid, N. Rapid quantitative colourimetric tests for trinitrotoluene (TNT) in soil. Forensic. Sci. Int. 222 (1), 340-345 (2012).
