Design og utvikling av Aptamer-gull nanopartikkel-basert kolo Analyser for In-the-feltet Applications

Summary

Utforming og utvikling av en aptamer-gull nanopartikkel kolorimetrisk analyse for påvisning av små molekyler for in-the-feltet applikasjoner ble undersøkt. I tillegg ble en smart-anordning kolorimetrisk applikasjon (app) validert og langtidslagring av analysen ble etablert for bruk i felten.

Abstract

Utforming og utvikling av en aptamer-gull nanopartikkel (AuNP) kolorimetrisk analyse for påvisning av små molekyler for in-the-feltet applikasjoner ble undersøkt. Target selektiv AuNP basert farge analyser har blitt utviklet i kontrollerte laboratorie innstillinger proof-of-concept. Imidlertid har disse ordningene ikke blitt utøvd til et punkt av svikt for å fastslå praktisk bruk utover laboratoriet. Dette arbeidet beskriver en generisk tilnærming til design, utvikle og feilsøke et aptamer-AuNP kolo analyse for små molekyl analytter og bruke analysen for in-the-feltet innstillinger. Analysen er fordelaktig fordi adsorberte aptamerer passivere de nanopartikkel overflatene og gir et middel for å redusere og eliminere falske positive responser til ikke-mål analytter. Overgang dette systemet til praktisk bruk nødvendig å definere ikke bare holdbarheten av aptamer-AuNP analysen, men etablering av metoder og prosedyrer for å forlenge langtidslagring capabilities. Også en av de anerkjente bekymringer med kolo avlesning er belastningen på analytikere til å nøyaktig identifisere ofte subtile endringer i farge. For å minske ansvaret på analytikere i feltet, ble en farge analyse protokoll utviklet for å utføre de fargeidentifikasjons oppgaver uten behov for å utføre denne oppgaven på laboratorie karakter utstyr. Fremgangsmåten for å lage og testing av dataanalyse-protokoll er beskrevet. Men for å forstå og påvirke utformingen av adsorberte aptamer analyser, interaksjoner knyttet til aptamer, mål, og AuNPs krever videre studier. Den kunnskapen kan føre til skreddersøm aptamerer for økt funksjonalitet.

Introduction

Kolorimetri er en av de eldste teknikker som brukes i analytisk kjemi. For denne teknikk blir en kvalitativ eller kvantitativ bestemmelse av analytten gjort basert på fremstilling av en farget forbindelse ^1. Vanligvis fargeanalyser bruker reagenser som opplever en fargeforskyvning i nærvær av analytten art, noe som resulterer i en observerbar eller påvisbar fargeendring i det synlige lysspekteret. Kolorimetri har vært brukt i deteksjon av mål som strekker seg fra atomer, ioner og små molekyler til komplekse biologiske molekyler slik som deoksyribonukleinsyrer syrer (DNA), peptider og proteiner ^2-4. For de siste to tiårene, har nanomaterialer revolusjonert detekteringsområde analyser, spesielt med farge baserte analyser ^5-6. Kombinerer de unike kjemiske og fysiske egenskapene til nanomaterialer med et mål selektiv anerkjennelse element, slik som antistoffer, oligonukleotid aptamerer eller peptid aptamerer, har ført til oppblomstring in design og utvikling av kolorimetriske deteksjon analyser ^7.

Metall nanopartikler har en størrelse vist avhengig fargeendring egenskap, som har blitt utnyttet i utformingen av mange kolorimetriske assays. Gull nanopartikler (AuNPs) er av spesiell interesse på grunn av en særegen rød-til-blå fargeskift, da den dispergerte oppløsning av partikler blir indusert til å samle ^8, typisk gjennom den presise tilsetning av salt. Evnen til å kontrollere overgangen fra spredt (rød) til de aggregerte (blå) landene har ført til opprettelsen av kolorimetriske sensorer for ionisk, små molekylære, peptid, protein og cellulære mål ^2-4,9. Mange av disse sensorene anvende aptamerer som målet gjenkjennelse motiv.

Aptamerer er DNA eller ribonukleinsyre (RNA) molekyler valgt fra en tilfeldig pool av 10 ¹² -10 ¹⁵ forskjellige sekvenser ^10-11. Utvelgelsesprosessen identifiserer målet rekognisjon elementer med bindingsaffiniteter i lav nanomolar regimet, og den systematiske utviklingen av ligander ved eksponentiell berikelse (SELEX) er den mest kjente prosess ^12-13. Fordeler med oligonukleotid basert aptamerer for sensing bruksområder er enkel syntese, kontrollerbar kjemisk modifisering, og kjemisk stabilitet ^14-15.

En tilnærming til å skape en kolo analysen kombinerer nanomaterialer med anerkjennelse elementer, består av å kombinere disse to artene gjennom fysisk adsorpsjon av DNA-aptamer molekyler til AuNP overflater. Gjennom target-aptamer binding aptamer opplever en strukturell endring som endrer ^16-18 samvirkningen mellom aptamer med AuNP overflate, noe som fører til en induserbar rød-til-blå fargerespons ¹⁹ med tilsetning av salt. Denne forbløffende trekk ved AuNPs gir en observerbar kolo respons mekanisme for aptamer-baserte enheter som kan brukes til å designere kolorimetriske analyser for ulike analytter.

Farge analyser konstruert ved hjelp av ikke-kovalente, fysisk adsorberte DNA aptamerer på AuNP flater har stigmatisering av å være en svak sensorplattform på grunn av problemer med robusthet, en tilbøyelighet for svikt utenfor kontrollerte laboratorie innstillinger, og mangel på informasjon som er tilgjengelig for bruk i praktisk innstillinger. Men aptamer-AuNP basert kolo analysen var av interesse på grunn av enkelhet av drift og observerbare fargerespons. Målet med dette arbeidet er å gi en protokoll for design, utvikling, drift, reduksjon av overflaterelaterte falsk positiv respons, og langtidslagring av DNA-AuNP basert kolorimetriske analyser ved hjelp av kokain som representant analytten. Videre foreslo vi dette adsorbert aptamer analysen tilnærming (figur 1) som fordelaktig på grunn av enkelhet og brukervennlighet som resulterte i færre trinn enn den konvensjonelle tilnærmingen for disse aptamer-AuNP assays. For denne analysen ble det aptamer først tilsatt til AuNPs, som ble tillatt å adsorbere til overflaten for en lengre periode. En ytterligere fordel med denne fremgangsmåten var reduksjonen av responsen på ikke-målanalytten molekyler relatert til AuNP overflate interaksjoner. Imidlertid er reduksjonen i falsk positiv reaksjon var på bekostning av analysesensitiviteten. Derfor en balanse mellom overflatebeskyttelse og analyse tilgjengelighet er nødvendig for å opprettholde riktig analyse funksjon. Videre er en stor mangel for å analysere fargeanalyser gjennom andre måter enn med instrumentering er at resultatene ofte er subjektiv og åpne for tolkning fra analytiker-til-analytiker, særlig ved forsøk på å skille små forskjeller i farge. Motsatt finnes det en rekke problemer med å gjøre laboratorie basert instrumentering bruk utenfor laboratoriet, for eksempel tilgjengelighet av makt, praktisk med portabilitet, etc. I dette arbeidet ble en fargeanalyse protokoll utviklet for more portabilitet og for å eliminere noen av gjetting vanligvis forbindes med farge basert analysen tolkning ^20-21. Sammenlignet med tidligere tilnærminger, dette arbeidet forsøkt å presse disse analysene til sine grenser for applikasjoner utover laboratoriet.

Protocol

1. Syntese via Citrate Reduksjon av gull nanopartikler (AuNP) og karakterisering Rense en Erlenmeyer-kolbe (500 ml) og stor rørestav med 5 ml konsentrert salpetersyre og 15 ml konsentrert saltsyre i kjemisk avtrekkshette. Fukte hele overflaten av kolben med syrevaske, skylle kolben med nuklease fritt vann, og la kolben for å tørke. Legg 100 ml 1 mM gull (III) klorid; bruker et ark av aluminiumsfolie for å dekke toppen av syren renset Erlenmeyer-kolbe og varme under kontinuerli…

Representative Results

Hovedmålet med dette arbeidet var å utvikle og undersøke stabilitet og robusthet aptamer basert AuNP kolorimetriske analyser for bruk i felten. Som fremhevet i en tidligere publikasjon, ble to forskjellige strategier for å skape analysen undersøkte 7. Analysene ble betegnet Free Aptamer-analysen og de adsorberte Aptamer-analysen. Den Absorbert Aptamer analysen var mer attraktivt i forbindelse med en fieldable gjenkjenning analysen (figur 1). <p …

Discussion

I løpet av det siste tiåret, har nanopartikkel basert kolorimetriske analyser er utviklet for påvisning av mål inkluderer små molekyler, DNA, proteiner og celler ^2-4. Analyser som bruker DNA-aptamerer med nanopartikler har blitt stadig mer interesse. Vanligvis blir disse kolorimetriske analyser utført ved å blande DNA-aptamer med analytt-molekyler, etterfulgt av tilsetning til AuNPs ^9-10. Imidlertid har disse analysene er benyttet i proof-of-concept demonstrasjoner med kontrollerte laborator…

Materials

Gold(III) chloride hydrate	Sigma	254169	99.999% purity is important and solutions were made fresh every time
Sodium Citrate Dihydrate	Sigma	W302600-1KG-K	We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and solutions were made fresh every time
Synergy	Bio-TEK	HT	Any absorbance spectrometer will work, but a platereader provides multiple sample analysis
4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) Buffer, 1 M sterilized	Amresco	J848	Any sterilized brand will work
Corning, 250 mL Filter System, 0.22 µm cellulose acetate	Fisher	430767	Other membranes have been found to remove the AuNPs
UV Spectrophophotometer	Varian	Cary 300	Any absorbance spectrometer will work
Magnesium Chloride Hexahydrate	Fluka	63068	≥98% any brand will work
DNA	IDT	Custom	DNA was purified with a desalting column, higher purification techniques can be used
Procaine Hydrochloride	ACROS	AC20731-1000	99% stocks of 1 mg/mL in methanol were prepared
Hydrochloric Acid	Fisher	A144S-500	36.5-38.0% w/w other brands will work
Cocaine Hydrochloride	Lipomed	COC-156-HC-1LM	We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays
Nitric Acid	Fisher	A509-SK212	65% w/w other brands will work
Sodium Chloride Solution, 5 M bioreagent grade	Sigma	S5150-1L	Sterile solutions made from solid will work
Diethyl Pyrocarbonate	Sigma	D5758-25 mL	≥97% any brand will work
Ecgoninemethylester Hydrochloride	Lipomed	COC-205-HC-1LM	We obtained the EME control from the same manufacturer as the cocaine target
Microcentrifuge Tubes, Axygen Scientific, nonsterile, 1.7mL	VWR	10011-722	We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and the tubes were autoclaved in house
nuclease free water
methanol