Cryo-tarama elektron mikroskobu tarafından Freeze-kırık Yaprak Dokular içinde Fotosentez Membranlarının Supramoleküler organizasyonu incelenmesi
Summary
Here we describe a procedure for studying freeze-fractured plant tissues. High-pressure frozen leaf samples are freeze-fractured and double-layer coated, yielding well preserved frozen-hydrated samples that are imaged using the cryo-scanning electron microscope at high magnifications with minimal beam damage.
Abstract
Dondurularak kırık numunelerin Cryo-taramalı elektron mikroskobu (SEM) yakın yerli koşullarında biyolojik yapıların soruşturma sağlar. Burada, yaprak örneklerinde içinde fotosentetik (tilakoit) membranların supramoleküler örgütü incelemek için bir teknik açıklar. Bu yüksek basınçlı yaprak dokularının dondurma, dondurma-kırılma, çift katmanlı bir kaplama ve son olarak kriyo-SEM görüntü alma ile elde edilir. çift katmanlı kaplama yönteminin kullanımı yüksek büyütme elde veriyor (> 100,000X) dondurulmuş sulu numuneler için en az ışın hasar yanı sıra en az şarj etkileri ile görüntüler. Açıklanan prosedürler kullanılarak in situ, diriliş bitki Craterostigma pumilum dehidrasyonu sırasında gerçekleşecek fotosistem ve hafif hasat anten protein kompleksleri supramoleküler dağılımındaki değişiklikler araştırıldı.
Introduction
Oksijenik fotosentez, antik siyanobakteri menşeli, kloroplast organelle gelişmesine yol açmıştır endosimbioz olaylarla yosun ve kara bitkileri tarafından miras. Bütün günümüz oksijenik fototroflardır olarak, fotosentetik elektron taşıma ve proton motif kuvvet üretimi ve indirgeme gücü 'tilakoit' membranlar olarak adlandırılan düzleştirilmiş kese benzer kesecikler içinde yürütülmektedir. Bu membranlar fotosentezin ışık güdümlü reaksiyonlar yürütmek ve enerji iletimi için bir ortam sağlamak protein kompleksleri ev. Bitkiler ve (bazı) alg tilakoit membranlar iki ayrı morfolojik etki alanlarına ayrılır: 'stroma lamel' olarak adlandırılan 'grana' ve granaları birbirine istiflenmemiş membranlar denilen sıkı appressed zar bölgeleri, 1. bitki ve alg tilakoit membranlarda çeşitli donma-fraktür çalışmaları 1970'lerde başlayarak gerçekleştirilmiştir. Ne zaman donma-kırık, membranlarHücresel bölmeye bağlı bir exoplasmic yüzü (EF) ve bir protoplazmik yüz (PF) üreten, kendi hidrofobik çekirdek 2 boyunca bölünmüş olan yarı-zar sınırları, aslında Branton ve arkadaşları tarafından icat olarak. ., sırasıyla 's' ve 'u' ifade eden 'yığılmış' ve 'unstacked' zar bölgeleri ile, EF'lerine, EFU, Proje Fişlerini ve Pfu: 1975 yılında 3 Bitki ve alg thylakoid dört farklı kırılma yüzleri var. bölünmüş veya kırık olmayan membran protein kompleksleri, E veya zarın P tarafı biriyle kalması eğilimi var. Thylakoid'in farklı kırılma yüzeyleri farklı büyüklüklerde olan ve yoğunluklarını 4 ve ardından çok sayıda soruşturma içeren ilk gözlem, açık reaksiyonlar yürütmek görülen parçacıklar ve membran protein kompleksleri ile tanımlanması ve korelasyon yol 5-13 (ayrıca bkz 14,15 değerlendirmeleri).
fretilakoit membranların eze-kırık deneyler genellikle izolasyon işlemi sırasında oluşabilecek yapısal ve / veya supramoleküler kuruluşta herhangi bir değişiklik riski, (ama 16,17 bakınız) kloroplastlar veya izole tilakoit membranlarda hazırlıkları yürütülmektedir. Kırık ardından kopyaları daha sonra karbon (C) ve kalın bir tabaka ile platin / karbon (Pt / C), buharlaştırma ile hazırlanır, ve biyolojik madde 18 son olarak sindirim. Replicas transmisyon elektron mikroskobu (TEM) tarafından görüntülenmiştir. Geleneksel dondurarak kırık-çoğaltma tekniği farklı için supramoleküler fotosentez membranların organizasyon ve adaptasyon eğitimi için önemli bir araç, örneğin olarak hizmet vermeye devam etmektedir., Hafif, koşullar 19-23.
Craterostigma 24 pumilum homoiochlorophyllous diriliş bitki bizim son çalışmada, biz supramoleküler organizasyon o değişiklikleri incelemeyi amaçladıkdehidrasyon ve rehidrasyon sırasında f tilakoit membranlar yanı sıra genel hücresel organizasyonu. homoiochlorophyllous Resurrection tür özgünlüğü onların fotosentetik cihaz koruyarak, kendi bitkisel dokularda (yaprak) içinde kuruma koşulları hayatta mümkün olmasıdır. Su kullanılabilir olduğunda, bu bitkiler kurtarmak ve birkaç gün ila 25 saat içinde fotosentez etkinliğini devam ettirir. Bu çalışma için, donma-kırık yaprak örneklerinin cryo-tarama EM (SEM) görüntüleme yüksek basınçlı örnek cryo-Hareketsizleştirmesi için dondurma ile kombine edildi. Bu işlemler kendi ana devlete 26 yakın bir devlet olarak dondurulmuş sulu biyolojik örnekler görselleştirmek için bir araç sağlar. Bir ana yararı örnekleri herhangi bir ardışık adımlarda ile dondurularak kırılma ve kaplamanın hemen sonra incelenir olmasıdır. hidrasyon durumu hazırlanması sırasında korunur gibi bu, farklı bağıl su içeriği (RWC) bitkilerin araştırılmasında özellikle uygundur. NasılHiç, bir kritik dezavantaj fotosentez komplekslerinin büyüklüğünün doğru ölçümü için gerekli olan yüksek büyütme, tarandığında dondurulmuş sulu numuneler özellikle, görüntüleme sırasında kiriş hasar muzdarip olabilir olmasıdır. Bunun üstesinden gelmek için, bir yöntem 'çift katmanlı kaplama' (DLC) özel cryo-SEM görüntüleme koşulları yararlanılmıştır ile birlikte 27,28 denir. Bunlar önemli ölçüde daha az ışın duyarlı numunelerin sonuçlandı ve fotosentetik protein supramoleküler örgütü ve diriliş bitki C diğer hücresel bileşenleri hakkında değerli bilgiler aydınlatılması için izin in situ yüksek büyütme oranlarında pumilum.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda anlatılan teknik cryo-tarama elektron mikroskobu ile iyi korunmuş yüksek basınçlı donmuş bitki dokularının kapsamında dondurularak kırık membranların soruşturma sağlar. Bu prosedürler kullanılarak en büyük avantajı, numune hazırlama tamamen fiziksel olmasıdır; kimyasallar veya dehidratasyon içeren hiçbir adım gereklidir. Bu nedenle, yakın bir Yerli durumda 26,32 biyolojik yapılar üzerinde çalışma sağlar. Yaprak dokuları kullanmanın yararı bir kloroplast içinde, …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz elektron mikroskobu görüntüleme tarayarak onun yararlı tavsiyeler için Andres KAECH (Zürih Üniversitesi) teşekkür ederim. Bu çalışma ABD-İsrail Binational Tarımsal Araştırma ve Geliştirme Fonu (hayır verin. ABD-4334-10, ZR), İsrail Bilim Vakfı (hayır verin. 1034/12, ZR) ve İnsan Frontier Bilim Programı tarafından desteklenen (RGP0005 / 2013 ZR). elektron mikroskobu çalışmaları Weizmann Bilim Enstitüsü Irving ve Nano için Cherna Moskowitz Merkezi ve Bio-Nano Görüntüleme yürütülmüştür.
Materials
| ethanol abs | Bio-Lab | 052505 | |
| isopropanol | Bio-Lab | 162605 | |
| 1-hexadecene | Sigma-Aldrich | H7009 | |
| 0.1/0.2 platelets | Engineering Office M. Wohlwend GmbH, Switzerland | 241 | Platelets are of 3-mm diameter and 0.5-mm-thick (Type A) with 0.1/0.2-mm-deep cavities (of diamater 2 mm). Similar platelets can be obtained from Leica Microsystems. |
| high-precision-grade tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72706-01 | Dumont (Switzerland) Durostar style #5 tweezers; Can be substituted with other high-precision tweezers. |
| high-pressure freezing machine | Bal-Tec | HPM 010 | High-pressure freezing alternatives: 1. HPF Compact 02, Wohlwend GmbH; 2. HPM 010, RMC Boeckeler; 3. EM PACT2, Leica Microsystems; 4. EM HPM 100, Leica Microsystems; 5. EM ICE, Leica Microsystems. |
| freeze-fracture system | Leica Microsystems | EM BAF 060 | |
| cryo preparation loading stage | Leica Microsystems | 16770228 | |
| specimen holder for univeral freeze fracturing | Leica Microsystems | 16LZ04746VN | Clamp holder for specimen carriers of diameter 3 mm |
| vacuum cryo-transfer shuttle | Leica Microsystems | EM VCT 100 | |
| scanning electron microscope | Zeiss | Ultra 055 | |
| cryo SEM stage | Leica Microsystems | 16770299905 | |
| image acquisiton software | SmartSEM, Carl Zeiss Microscopy GmbH | ||
| image analysis software | Fiji/Image J, National Institute of Health | http://fiji.sc/Fiji |
References
- Anderson, J. M. Insights into the consequences of grana stacking of thylakoid membranes in vascular plants: a personal perspective. Aust. J. Plant Physiol. 26 (7), 625-639 (1999).
- Branton, D. Fracture Faces of Frozen Membranes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 55 (5), 1048-1056 (1966).
- Branton, D., et al. Freeze-Etching Nomenclature. Science. 190 (4209), 54-56 (1975).
- Goodenough, U. W., Staehelin, L. A. Structural Differentiation of Stacked and Unstacked Chloroplast Membranes – Freeze-Etch Electron Microscopy of Wild-Type and Mutant Strains of Chlamydomonas. J. Cell Biol. 48 (3), 594-619 (1971).
- Simpson, D. J. Freeze-Fracture Studies on Barley Plastid Membranes .6. Location of the P700-Chlorophyll a-Protein-1. Eur. J. Cell Biol. 31 (2), 305-314 (1983).
- Staehelin, L. A. Reversible Particle Movements Associated with Unstacking and Restacking of Chloroplast Membranes. Invitro. J. Cell Biol. 71 (1), 136-158 (1976).
- Miller, K. R. A Chloroplast Membrane Lacking Photosystem-I – Changes in Unstacked Membrane Regions. Biochim. Biophys. Acta. 592 (1), 143-152 (1980).
- Miller, K. R., Cushman, R. A. Chloroplast Membrane Lacking Photosystem-II – Thylakoid Stacking in the Absence of the Photosystem-II Particle. Biochim. Biophys. Acta. 546 (3), 481-497 (1979).
- Miller, K. R., Staehelin, L. A. Analysis of Thylakoid Outer Surface – Coupling Factor Is Limited to Unstacked Membrane Regions. J. Cell Biol. 68 (1), 30-47 (1976).
- Simpson, D. J. Freeze-Fracture Studies on Barley Plastid Membranes .3. Location of the Light-Harvesting Chlorophyll-Protein. Carlsberg Res. Commun. 44 (5), 305-336 (1979).
- Olive, J., Recouvreur, M., Girardbascou, J., Wollman, F. A. Further Identification of the Exoplasmic Face Particles on the Freeze-Fractured Thylakoid Membranes – a Study Using Double and Triple Mutants from Chlamydomonas-Reinhardtii Lacking Various Photosystem-Ii Subunits and the Cytochrome B6/F Complex. Eur. J. Cell Biol. 59 (1), 176-186 (1992).
- Olive, J., Vallon, O., Wollman, F. A., Recouvreur, M., Bennoun, P. Studies on the Cytochrome B6/F Complex .2. Localization of the Complex in the Thylakoid Membranes from Spinach and Chlamydomonas-Reinhardtii by Immunocytochemistry and Freeze-Fracture Analysis of B6/F Mutants. Biochim. Biophys. Acta. 851 (2), 239-248 (1986).
- Armond, P. A., Staehelin, L. A., Arntzen, C. J. Spatial Relationship between Light Harvesting Complex and Photosystem-1 and Photosystem-2 in Stacked and Unstacked Chloroplast Membranes. J. Cell Biol. 70 (2), 400-418 (1976).
- Staehelin, L. A. Chloroplast structure: from chlorophyll granules to supra-molecular architecture of thylakoid membranes. Photosynth. Res. 76 (1-3), 185-196 (2003).
- Nevo, R., Charuvi, D., Tsabari, O., Reich, Z. Composition, architecture and dynamics of the photosynthetic apparatus in higher plants. Plant J. 70 (1), 157-176 (2012).
- Platt, K. A., Oliver, M. J., Thomson, W. W. Membranes and Organelles of Dehydrated Selaginella and Tortula Retain Their Normal Configuration and Structural Integrity – Freeze-Fracture Evidence. Protoplasma. 178 (1-2), 57-65 (1994).
- Platt-Aloia, K. A., Thomson, W. W. Advantages of the use of intact plant tissues in freeze-fracture electron microscopy. J. Electron Microsc. Tech. 13 (4), 288-299 (1989).
- Carson, J. L. Fundamental technical elements of freeze-fracture/freeze-etch in biological electron microscopy. J. Vis. Exp. (91), e51694 (2014).
- Kirchhoff, H., et al. Low-light-induced formation of semicrystalline photosystem II arrays in higher plant chloroplasts. Biochimie. 46 (39), 11169-11176 (2007).
- Johnson, M. P., et al. Photoprotective Energy Dissipation Involves the Reorganization of Photosystem II Light-Harvesting Complexes in the Grana Membranes of Spinach Chloroplasts. Plant Cell. 23 (4), 1468-1479 (2011).
- Kirchhoff, H., Tremmel, I., Haase, W., Kubitscheck, U. Supramolecular photosystem II organization in grana thylakoid membranes: evidence for a structured arrangement. Biochimie. 43 (28), 9204-9213 (2004).
- Belgio, E., Ungerer, P., Ruban, A. V Light-harvesting superstructures of green plant chloroplasts lacking photosystems. Plant Cell Environ. , (2015).
- Goral, T. K., et al. Light-harvesting antenna composition controls the macrostructure and dynamics of thylakoid membranes in Arabidopsis. Plant J. 69 (2), 289-301 (2012).
- Charuvi, D., et al. Photoprotection Conferred by Changes in Photosynthetic Protein Levels and Organization during Dehydration of a Homoiochlorophyllous Resurrection Plant. Plant Physiol. 167 (4), 1554-1565 (2015).
- Farrant, J. M., Brandt, W., Lindsey, G. G. An Overview of Mechanisms of Desiccation Tolerance in Selected Angiosperm Resurrection Plants. Plant Stress. 1 (1), 72-84 (2007).
- Walther, P., Schatten, H., Pawley, J. B. High-resolution cryoscanning electron microscopy of biological samples. Biological Low-Voltage Scanning Electron Microscopy. , 245-261 (2008).
- Walther, P., Müller, M. Double-layer coating for field-emission cryo-scanning electron microscopy–present state and applications. Scanning. 19 (5), 343-348 (1997).
- Walther, P., Wehrli, E., Hermann, R., Müller, M. Double-layer coating for high-resolution low-temperature scanning electron microscopy. J. Microsc. 179, 229-237 (1995).
- Hess, M. W. Cryopreparation methodology for plant cell biology. Cell. Electron Microsc. 79, 57-100 (2007).
- Schertel, A., et al. Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens. J. Struct. Biol. 184 (2), 355-360 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Walther, P. Recent progress in freeze-fracturing of high-pressure frozen samples. J. Microsc. 212 (1), 34-43 (2003).
- Nevo, R., et al. Architecture of Thylakoid Membrane Networks. Lipids Photosynth. 30, 295-328 (2009).
