Intravitale Imaging van neutrofielen Priming gebruik van IL-1β-Promoter gedreven DsRed Reporter Muizen
Summary
This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.
Abstract
Neutrofielen zijn de meest voorkomende leukocyten in de menselijke bloedsomloop en worden snel aangeworven om inflammatoire sites. Priming is een situatie voordoet die de fagocytische functionaliteit van neutrofielen verhoogt. Hoewel uitgebreide studies van het bestaan en het belang van neutrofielen priming tijdens infectie en schade hebben onthuld, betekent visualiseren dit proces in vivo zijn niet beschikbaar geweest. De geleverde protocol maakt bewaking van het dynamische proces van neutrofiel priming in levende dieren door de combinatie van drie methoden: 1) DsRed reporter signaal – gebruikt als maat voor priming 2) in vivo neutrofiel labeling – bereikt door injectie van fluorescentie-geconjugeerd anti-lymfocyt antigen 6G (Ly6G) monoklonaal antilichaam (mAb) en 3) intravitale confocale beeldvorming. Verschillende kritische stappen zijn betrokken bij dit protocol:-oxazolon geïnduceerde muis oor ontsteking van de huid, geschikte sedatie van de dieren, herhaalde injecties van anti-Ly6G mAb en prevention focus drift tijdens de beeldvorming. Hoewel enkele beperkingen waargenomen, zoals de grens van continue beeldvorming tijd (~ 8 uur) in een muis en het lekken van fluoresceïne-isothiocyanaat-dextran van bloedvaten in de ontstekingstoestand Dit protocol verschaft een basiskader voor intravitale beeldvorming van geprimede neutrofiel gedrag en functie, die gemakkelijk kan worden uitgebreid tot het onderzoek van andere immuuncellen in muizen inflammatiemodellen.
Introduction
Neutrofielen zijn de meest voorkomende en kortstondige leukocyten in omloop. Ze zijn snel aangeworven om de sites van de infectie of letsel, waar ze dienen als professionele fagocyten door de afgifte van reactieve zuurstof en stikstof tussenproducten, samen met korrels die antimicrobiële peptiden en proteasen 1. Bij rekrutering, neutrofielen worden "geprimed" door verschillende middelen waaronder microbiële producten, chemoattractanten en inflammatoire cytokines, wat resulteert in sterk verhoogde fagocyt-functionaliteit bij aankomst op de plaats van de ontsteking 2. De mechanismen van neutrofiel priming zijn uitgebreid bestudeerd in vitro 3,4; echter, heeft dynamische controle van het proces in vivo niet mogelijk geweest tot nu toe.
Recent is intravitale imaging een belangrijke techniek voor het visualiseren en kwantificeren van de dynamica van cellulaire biologische processen in levende organismen worden. Intravital beeldvorming kan worden uitgevoerd via conventionele foton excitatie microscopie (bijvoorbeeld, confocale) of multifoton microscopie benaderingen 5. Na verloop van tijd, zijn substantiële verbeteringen gerealiseerd in deze techniek waardoor verhoogde beeldresolutie, betere beeldvorming diepte, verminderde weefsel photodamage en verbeterde beeldstabilisatie 6,7. Gezien de unieke mogelijkheid om dynamische visualisatie van cellulaire migratie en interactie in de tijd mogelijk te maken, is intravitale microscopie is uitgebreid toegepast op diverse gebieden van onderzoek in de immunologie 8. Intravitale beeldvorming maakt immunologen beter te begrijpen en contextualiseren immuunreacties op zowel het cellulair en moleculair niveau in levende diermodellen.
Recente ontwikkelingen in de transgene als knock-in reporter muizen hebben verstrekt handige tools voor het bewaken van het dynamische gedrag van neutrofielen in levende dieren. Lysozym M promoter aangestuurde versterkt groen fluorescent proteïne knock-inmuizen werden breed gebruikt om beweeglijkheid van neutrofielen, monocyten en macrofagen karakteriseren in verschillende ontstekingsprocessen zoals extravasatie, bacteriële infecties en steriele ontstekingen 9-15. Verder zijn transgene muizen die een cytoplasmatische fluorescentie-energieoverdracht biosensor toegepast bij het bestuderen van de activiteiten van neutrofielen extracellulair gereguleerde kinase mitogen en proteïne kinase A in ontstoken darm 16. Een muizenmodel met hoge specificiteit voor fluorescentie expressie in neutrofielen is de Catchup knock-in muizen, waarin Cre recombinase produceert en het fluorescerende eiwit tdTomato, die zelf is gekoppeld om expressie van lymfocyt antigen 6G (Ly6G) 17. Visualisatie van Ly6G-deficiënte neutrofielen via dit model heeft aangetoond dat deze cellen uitoefenen normale functioneren met steriele of infectieuze ontstekingen in vivo context. Transgene muizen die de DsRed fluorescerende pProtein gen onder controle van de muis interleuikin-1β (IL-1β) promoter (pIL1-DsRed) werden gebruikt om de beweeglijke gedrag van IL-1β cellen zichtbaar – vermoedelijk neutrofielen, inflammatoire monocyten en geactiveerde macrofagen omvatten – opkomende in ontstoken huid 18.
In vivo kan de etikettering dienen als een alternatieve aanpak voor het traceren van de cellulaire en moleculaire gedrag van neutrofielen in ontstoken weefsel. Na intraveneuze injectie van lage doses van fluorescent gemerkt anti-Gr-1 monoklonaal antilichaam (mAb), de werving cascade van Gr-1 + neutrofielen werd gevisualiseerd in de muis huidletsels die besmet zijn met Staphylococcus aureus 19. In vivo toediening van conjugaten met streptavidine geconjugeerd 705 nm quantum dots en gebiotinyleerd anti-Ly6G mAb specifiek label circulerende neutrofielen 20. Bovendien endocytose van dergelijke conjugaten in neutrophil vesicles maakt het volgen van snelle vesicle transport in neutrofielen migreren in het interstitium. In vivo labeling met fluorescentie-geconjugeerde antilichamen tegen P-selectine glycoproteïne ligand-1 (PSGL-1), L-selectine (CD62L), integrine αM (CD11b ) en chemokine (CXC motief) receptor 2 (CXCR2) in een TNFa-geïnduceerde inflammatoire model heeft de regulerende mechanismen in het spel toegelicht tijdens de vroege ontsteking 21. Gepolariseerde neutrofielen uitsteken PSGL-1 verrijkte uropods om met CD62L aanwezig op geactiveerde bloedplaatjes, waardoor de herverdeling van CD11b en CXCR2, receptoren die neutrofielen migratie rijden en initiëren van de ontsteking.
IL-1β is een van de handtekening genen die verhoogd is geprimed 22 neutrofielen. In pIL1-DsRed reportermuizen, DsRed fluorescentiesignalen (bijv. Activering van IL-1β promoter) positief correleren met IL-1β mRNA expressie en IL-1β eiwitproductie. <sup> 18 Om het proces van neutrofiel priming controleren, werd een intravitale microscopie methode ontwikkeld waarbij inductie van huidontsteking met oxazolon (OX) in pIL1-DsRed muismodel na in vivo labeling van neutrofielen met fluorescentie-geconjugeerd anti-Ly6G mAb. Via dit model is het mogelijk om het gedrag en functie van geprimede neutrofielen in diermodellen van verschillende ziekten en aandoeningen te bestuderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het doel van deze studie is om een technologie te ontwikkelen voor het monitoren van het proces van neutrofiel priming in levende dieren, die nog niet is vervuld door de huidige beschikbare technieken. Om dit doel te bereiken, worden drie gevestigde methoden uitgevoerd: 1) inductie van huidontsteking in IL-1β-promoter gedreven DsRed reportermuizen als maat voor priming, 2) in vivo labeling van neutrofielen met lage doses van fluorescentie-geconjugeerd anti-Ly6G mAb, en 3) intravitale microscopie confocal…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Heparin sodium | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-540-31 | |
| ACK lysing buffer | Lonza | 10-548E | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Lipopolysaccharides | Sigma-Aldrich | L4391 | |
| Ketamine hydrochloride | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Xylazine | LLOYD Laboratory | NADA #139-236 | |
| Acepromazine | Boehringer Ingelheim | ANADA 200-361 | |
| Hair-removal cream | Church & Dwight | ||
| Acetone | Fisher Scientific | A16P4 | |
| Oxazolone | Sigma-Aldrich | E0753 | |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G antibody | BioLegend | 127610 | |
| U-100 insulin syringe with 28 G needle | BD | 329461 | |
| FITC-CM-Dextran, 150 Kda | Sigma-Aldrich | 74817 | |
| Butterfly infusion set (27 G needle) | BD | 387312 | |
| FACSCalibur cytometer | BD | ||
| CellQuest Pro software | BD | ||
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Metamorph Software | Universal Imaging |
References
- Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nat. Immunol. 15 (7), 602-611 (2014).
- Kobayashi, S. D., Voyich, J. M., Burlak, C., DeLeo, F. R. Neutrophils in the innate immune response. Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). 53 (6), 505-517 (2005).
- Condliffe, A. M., Kitchen, E., Chilvers, E. R. Neutrophil priming: pathophysiological consequences and underlying mechanisms. Clin. Sci. (Lond). 94 (5), 461-471 (1998).
- El-Benna, J., Dang, P. M., Gougerot-Pocidalo, M. A. Priming of the neutrophil NADPH oxidase activation: role of p47phox phosphorylation and NOX2 mobilization to the plasma membrane. Semin. Immunopathol. 30 (3), 279-289 (2008).
- Benson, R. A., McInnes, I. B., Brewer, J. M., Garside, P. Cellular imaging in rheumatic diseases. Nat. Rev. Rheumatol. 11 (6), 357-367 (2015).
- Herz, J., Zinselmeyer, B. H., McGavern, D. B. Two-photon imaging of microbial immunity in living tissues. Microsc. Microanal. 18 (4), 730-741 (2012).
- Tang, J., van Panhuys, N., Kastenmuller, W., Germain, R. N. The future of immunoimaging–deeper, bigger, more precise, and definitively more colorful. Eur. J. Immunol. 43 (6), 1407-1412 (2013).
- Weigert, R., Porat-Shliom, N., Amornphimoltham, P. Imaging cell biology in live animals: ready for prime time. J. Cell. Biol. 201 (7), 969-979 (2013).
- Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. J. Invest. Dermatol. 131 (10), 2058-2068 (2011).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Finsterbusch, M., Voisin, M. B., Beyrau, M., Williams, T. J., Nourshargh, S. Neutrophils recruited by chemoattractants in vivo induce microvascular plasma protein leakage through secretion of TNF. J. Exp. Med. 211 (7), 1307-1314 (2014).
- Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S inhibits neutrophil recruitment during the early stages of Streptococcus pyogenes infection. Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).
- Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain. J. Neuroinflammation. 9 (50), (2012).
- Chen, X., et al. In vivo multi-modal imaging of experimental autoimmune uveoretinitis in transgenic reporter mice reveals the dynamic nature of inflammatory changes during disease progression. J. Neuroinflammation. 12 (17), (2015).
- Slaba, I., et al. Imaging the Dynamic Platelet-Neutrophil Response in Sterile Liver Injury and Repair in Mice. Hepatology. , (2015).
- Mizuno, R., et al. In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines. J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).
- Hasenberg, A., et al. Catchup: a mouse model for imaging-based tracking and modulation of neutrophil granulocytes. Nat. Methods. 12 (5), 445-452 (2015).
- Matsushima, H., et al. Intravital imaging of IL-1beta production in skin. J. Invest. Dermatol. 130 (6), 1571-1580 (2010).
- Yipp, B. G., Kubes, P. Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo. Blood. 121 (1), 241-242 (2013).
- Kikushima, K., Kita, S., Higuchi, H. A non-invasive imaging for the in vivo tracking of high-speed vesicle transport in mouse neutrophils. Sci. Rep. 3, (1913).
- Sreeramkumar, V., et al. Neutrophils scan for activated platelets to initiate inflammation. Science. 346 (6214), 1234-1238 (2014).
- Yao, Y., et al. Neutrophil priming occurs in a sequential manner and can be visualized in living animals by monitoring IL-1beta promoter activation. J. Immunol. 194 (3), 1211-1224 (2015).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim. (NY). 34 (9), 39-43 (2005).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice). Lab. Anim. (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
- Fotos, J. S., et al. Automated time-lapse microscopy and high-resolution tracking of cell migration). Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).
- Mizumoto, N., et al. Discovery of novel immunostimulants by dendritic-cell-based functional screening. Blood. 106 (9), 3082-3089 (2005).
- Cassatella, M. A. Neutrophil-derived proteins: selling cytokines by the pound. Adv. Immunol. 73, 369-509 (1999).
- Grahames, C. B., Michel, A. D., Chessell, I. P., Humphrey, P. P. Pharmacological characterization of ATP- and LPS-induced IL-1beta release in human monocytes. Br. J. Pharmacol. 127 (8), 1915-1921 (1999).
- Levin, M., Leibrecht, H., Ryan, J., Van Dolah, F., De Guise, S. Immunomodulatory effects of domoic acid differ between in vivo and in vitro exposure in mice. Mar. Drugs. 6 (4), 636-659 (2008).
- Basu, S., Hodgson, G., Katz, M., Dunn, A. R. Evaluation of role of G-CSF in the production, survival, and release of neutrophils from bone marrow into circulation. Blood. 100 (3), 854-861 (2002).
- Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1048, 321-330 (2005).
- Zucker, R. M. Quality assessment of confocal microscopy slide-based systems: instability. Cytometry A. 69 (7), 677-690 (2006).
- Hogan, H. Focusing on the experiment. Biophotonics. Int. 13, 48-51 (2006).
- Kabashima, K., Egawa, G. Intravital multiphoton imaging of cutaneous immune responses. J. Invest. Dermatol. 134 (11), 2680-2684 (2014).
- Egawa, G., Natsuaki, Y., Miyachi, Y., Kabashima, K. Three-dimensional imaging of epidermal keratinocytes and dermal vasculatures using two-photon microscopy. J. Dermatol. Sci. 70 (2), 143-145 (2013).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nat. Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A method for 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window. J. Vis. Exp. (12), (2008).
- Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nat. Protoc. 8 (3), 583-594 (2013).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat. Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
