न्युट्रोफिल भड़काना के intravital इमेजिंग आईएल 1β प्रमोटर संचालित DsRed रिपोर्टर चूहों का उपयोग
Summary
This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.
Abstract
न्यूट्रोफिल मानव रक्त परिसंचरण में सबसे प्रचुर मात्रा में ल्यूकोसाइट्स कर रहे हैं और जल्दी से भड़काऊ साइट्स के लिए भर्ती कर रहे हैं। भड़काना एक महत्वपूर्ण घटना है कि न्यूट्रोफिल की phagocytic कार्यक्षमता को बढ़ाती है। हालांकि व्यापक अध्ययन के संक्रमण और चोट के दौरान अस्तित्व और न्यूट्रोफिल भड़काना के महत्व का अनावरण किया है, इस प्रक्रिया को विवो में उपलब्ध नहीं किया गया है visualizing का मतलब है। प्रतिदीप्ति संयुग्मित विरोधी लिम्फोसाइट प्रतिजन के इंजेक्शन द्वारा प्राप्त किया – 2) इन विवो न्यूट्रोफिल लेबलिंग भड़काना के एक उपाय के रूप में इस्तेमाल किया – 1) DsRed संवाददाता संकेत: प्रदान प्रोटोकॉल तीन तरीके के संयोजन से न्यूट्रोफिल रहने वाले जानवरों में भड़काना के गतिशील प्रक्रिया की निगरानी के लिए सक्षम बनाता है 6G (Ly6G) मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी) और 3) intravital confocal इमेजिंग। कई महत्वपूर्ण कदम इस प्रोटोकॉल में शामिल कर रहे हैं: oxazolone प्रेरित माउस कान त्वचा में सूजन, पशुओं के उचित बेहोश करने की क्रिया, विरोधी Ly6G एमएबी के बार-बार इंजेक्शन, और पिछलाइमेजिंग के दौरान ध्यान केंद्रित करने के बहाव के ention। हालांकि कुछ सीमाएं ऐसा ही एक माउस में निरंतर इमेजिंग समय (~ 8 घंटा) की सीमा और fluorescein आइसोथियोसाइनेट-dextran भड़काऊ राज्य में रक्त वाहिकाओं से रिसाव के रूप में मनाया गया है, इस प्रोटोकॉल के intravital इमेजिंग के लिए एक बुनियादी ढांचा प्रदान करता है primed न्यूट्रोफिल व्यवहार और समारोह है, जो आसानी से माउस सूजन मॉडल में अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं की परीक्षा के लिए विस्तारित किया जा सकता है।
Introduction
न्यूट्रोफिल संचलन में सबसे प्रचुर मात्रा में और अल्पकालिक ल्यूकोसाइट्स हैं। वे तेजी से संक्रमण या चोट की साइटों, जहां वे रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स और proteases 1 युक्त कणिकाओं के साथ प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन और नाइट्रोजन मध्यवर्ती की विज्ञप्ति के माध्यम के रूप में पेशेवर फ़ैगोसाइट की सेवा के लिए भर्ती कर रहे हैं। उनकी भर्ती के दौरान, न्यूट्रोफिल माइक्रोबियल उत्पादों, chemoattractants, और भड़काऊ साइटोकिन्स सहित विभिन्न एजेंटों द्वारा "primed" कर रहे हैं, सूजन 2 के एक स्थल पर आगमन पर स्पष्ट रूप से बढ़ाया भक्षककोशिकीय कार्यक्षमता में जिसके परिणामस्वरूप। न्यूट्रोफिल भड़काना के तंत्र में बड़े पैमाने पर इन विट्रो 3,4 में अध्ययन किया गया है; हालांकि, विवो में प्रक्रिया की निगरानी गतिशील तिथि करने के लिए संभव नहीं हो पाया है।
हाल ही में, intravital इमेजिंग visualizing और रहने वाले जीवों में जैविक प्रक्रियाओं की गतिशीलता सेलुलर बढ़ाता के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीक बन गया है। Intraviताल इमेजिंग पारंपरिक एक फोटॉन उत्तेजना माइक्रोस्कोपी के माध्यम से किया जा सकता है (जैसे, confocal) या multiphoton माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण 5। समय के साथ, पर्याप्त सुधार इस तकनीक वृद्धि की छवि संकल्प, बेहतर इमेजिंग गहराई को सक्षम करने में हासिल किया गया है, ऊतक photodamage, और बढ़ाया छवि स्थिरीकरण 6.7 कमी आई है। अपनी अनूठी सेलुलर प्रवास और समय के साथ बातचीत के गतिशील दृश्य सक्षम करने की क्षमता को देखते हुए, intravital माइक्रोस्कोपी बड़े पैमाने पर इम्यूनोलॉजी 8 में अध्ययन के विभिन्न क्षेत्रों के लिए लागू किया गया है। Intravital इमेजिंग बेहतर समझते हैं और पशु मॉडल में रहने वाले दोनों सेलुलर और आणविक स्तर पर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया contextualize करने immunologists सक्षम बनाता है।
ट्रांसजेनिक में हाल के अग्रिमों के रूप में अच्छी तरह से दस्तक संवाददाता चूहों के रूप में रहने वाले जानवरों में न्यूट्रोफिल के गतिशील व्यवहार की निगरानी के लिए उपयोगी उपकरण प्रदान की है। Lysozyme एम प्रमोटर संचालित बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन दस्तकचूहों को मोटे तौर पर परिस्त्राव, बैक्टीरियल संक्रमण, सूजन और बाँझ 9-15 सहित विभिन्न सूजन प्रक्रियाओं के दौरान न्यूट्रोफिल, monocytes, और मैक्रोफेज की गतिशीलता को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इसके अलावा, ट्रांसजेनिक चूहों एक cytoplasmic प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण biosensor व्यक्त सूजन आंत 16 के भीतर न्युट्रोफिल कोशिकी विनियमित माइटोजन काइनेज और प्रोटीन काइनेज एक की गतिविधियों के अध्ययन में नियोजित किया गया है। एक murine न्यूट्रोफिल में प्रतिदीप्ति अभिव्यक्ति के लिए उच्च विशिष्टता के साथ मॉडल कैटचप दस्तक माउस, जो Cre recombinase के रूप में अच्छी तरह का उत्पादन फ्लोरोसेंट प्रोटीन tdTomato, जो अपने आप लिम्फोसाइट प्रतिजन 6G (Ly6G) 17 की अभिव्यक्ति के लिए युग्मित है के रूप में है। इस मॉडल के माध्यम से Ly6G की कमी न्यूट्रोफिल के दृश्य का प्रदर्शन किया है कि इन कोशिकाओं बाँझ या में संक्रामक विवो भड़काऊ संदर्भों की एक किस्म में सामान्य कार्यक्षमता डालती है। ट्रांसजेनिक चूहों DsRed फ्लोरोसेंट पी व्यक्तन्यूट्रोफिल, भड़काऊ monocytes, और सक्रिय मैक्रोफेज शामिल करने के लिए माना जाता है – – माउस interleuikin-1β (आईएल 1β) प्रमोटर (pIL1-DsRed) आईएल 1β उत्पादक कोशिकाओं की गतिशील व्यवहार कल्पना करने के लिए उपयोग किया गया है के नियंत्रण में जीन rotein उभरते सूजन त्वचा 18 में।
विवो में लेबलिंग में सूजन के ऊतकों में न्यूट्रोफिल के सेलुलर और आणविक व्यवहार पता लगाने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में काम कर सकते हैं। लेबल विरोधी जीआर 1 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी) fluorescently की कम खुराक की नसों में इंजेक्शन, जीआर 1 + न्यूट्रोफिल की भर्ती के झरना के बाद स्ताफ्य्लोकोच्चुस 19 से संक्रमित माउस त्वचा के घावों में कल्पना की गई है। Streptavidin- युक्त conjugates के vivo प्रशासन संयुग्मित 705 एनएम क्वांटम डॉट्स और biotinylated विरोधी Ly6G एमएबी विशेष रूप से घूम न्यूट्रोफिल 20 लेबल। इसके अलावा, neutroph में इस तरह के conjugates के endocytosisआईएल पुटिकाओं interstitium में पलायन neutrophils में उच्च गति पुटिका परिवहन की ट्रैकिंग की अनुमति देता है। विवो में पी selectin के खिलाफ प्रतिदीप्ति संयुग्मित एंटीबॉडी, ग्लाइकोप्रोटीन ligand-1 (PSGL-1), एल selectin (CD62L) αM इंटीग्रिन साथ लेबलिंग (CD11b ) और केमोकाइन (CXC मूल भाव) रिसेप्टर 2 (CXCR2) एक TNFα प्रेरित भड़काऊ मॉडल के शुरू में सूजन 21 के दौरान खेलने पर विनियामक तंत्र elucidated किया गया है। फूट डालना न्यूट्रोफिल फैलाना PSGL-1-समृद्ध uropods CD11b और CXCR2, रिसेप्टर्स कि न्यूट्रोफिल प्रवास ड्राइव और सूजन आरंभ के पुनर्वितरण में जिसके परिणामस्वरूप, सक्रिय प्लेटलेट्स पर CD62L वर्तमान के साथ बातचीत करने के लिए।
आईएल 1β हस्ताक्षर जीन है कि primed न्यूट्रोफिल 22 में उठाया है में से एक है। PIL1-DsRed संवाददाता चूहों में, DsRed प्रतिदीप्ति संकेतों (अर्थात्।, आईएल 1β प्रमोटर के सक्रियण) सकारात्मक आईएल 1β mRNA अभिव्यक्ति और आईएल 1β प्रोटीन के उत्पादन के साथ संबंध स्थापित। <sup> 18 न्यूट्रोफिल भड़काना की प्रक्रिया पर नजर रखने के लिए, एक intravital माइक्रोस्कोपी विधि त्वचा की सूजन के प्रतिदीप्ति संयुग्मित विरोधी Ly6G एमएबी साथ न्यूट्रोफिल के vivo लेबलिंग निम्नलिखित pIL1-DsRed माउस मॉडल में oxazolone (बैल) के साथ प्रेरण शामिल विकसित किया गया था। इस मॉडल के माध्यम से, यह व्यवहार और विभिन्न बीमारियों और विकारों के पशु मॉडल में primed न्यूट्रोफिल के समारोह में अध्ययन करने के लिए संभव है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अध्ययन का उद्देश्य रहने वाले जानवरों, जो नहीं किया गया है अभी तक वर्तमान में उपलब्ध तकनीक के द्वारा पूरा किया गया में न्यूट्रोफिल भड़काना की प्रक्रिया की निगरानी के लिए एक तकनीक विकसित करने का है। इ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Heparin sodium | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-540-31 | |
| ACK lysing buffer | Lonza | 10-548E | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Lipopolysaccharides | Sigma-Aldrich | L4391 | |
| Ketamine hydrochloride | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Xylazine | LLOYD Laboratory | NADA #139-236 | |
| Acepromazine | Boehringer Ingelheim | ANADA 200-361 | |
| Hair-removal cream | Church & Dwight | ||
| Acetone | Fisher Scientific | A16P4 | |
| Oxazolone | Sigma-Aldrich | E0753 | |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G antibody | BioLegend | 127610 | |
| U-100 insulin syringe with 28 G needle | BD | 329461 | |
| FITC-CM-Dextran, 150 Kda | Sigma-Aldrich | 74817 | |
| Butterfly infusion set (27 G needle) | BD | 387312 | |
| FACSCalibur cytometer | BD | ||
| CellQuest Pro software | BD | ||
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Metamorph Software | Universal Imaging |
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