Imaging intravitale di neutrofili adescamento Utilizzando IL-1b Promoter-driven DsRed topi reporter
Summary
This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.
Abstract
I neutrofili sono i leucociti più abbondanti in circolazione del sangue umano e sono rapidamente reclutati ai siti infiammatori. L'adescamento è un evento critico che aumenta la funzionalità fagocitaria dei neutrofili. Sebbene studi approfonditi hanno svelato l'esistenza e l'importanza di neutrofili adescamento durante l'infezione e lesioni, i mezzi di visualizzare questo processo in vivo sono stati disponibili. Il protocollo fornito consente il monitoraggio del processo dinamico di neutrofili adescamento in animali viventi combinando tre metodologie: 1) Segnale giornalista DsRed – usato come misura di adescamento 2) in vivo etichettatura neutrofili – ottenuto mediante iniezione di fluorescenza coniugato antigene anti-linfociti 6G (Ly6G) anticorpo monoclonale (mAb) e 3) confocale intravitale. Diversi passaggi critici sono coinvolti in questo protocollo: Mouse infiammazione oxazolone indotta pelle orecchio, adeguata sedazione degli animali, ripetute iniezioni di anti-Ly6G mAb, e prevenzione fuoco deriva durante l'imaging. Sebbene alcune limitazioni sono stati osservati, come il limite di tempo di imaging continuo (~ 8 ore) in un mouse e la fuoriuscita di fluorescina isotiocianato-destrano dai vasi sanguigni in stato infiammatorio, questo protocollo fornisce un quadro fondamentale per l'imaging intravitale di comportamento innescato neutrofili e la funzione, che può essere facilmente ampliato per l'esame di altre cellule del sistema immunitario in modelli murini di infiammazione.
Introduction
I neutrofili sono i più abbondanti e di breve durata leucociti in circolazione. Essi stanno rapidamente reclutati per i siti di infezione o lesioni, dove servono fagociti come professionisti attraverso il rilascio di reattivi intermedi ossigeno e di azoto insieme con granuli contenenti peptidi antimicrobici e proteasi 1. Durante il loro reclutamento, i neutrofili sono "innescato" da vari agenti compresi i prodotti microbici, chemoattractants, e citochine infiammatorie, con conseguente funzionalità dei fagociti nettamente migliorata all'arrivo in un sito di infiammazione 2. I meccanismi di priming neutrofili sono state ampiamente studiate in vitro 3,4; Tuttavia, il monitoraggio dinamico del processo in vivo non è stato possibile finora.
Recentemente, l'imaging intravitale è diventata una tecnica importante per la visualizzazione e quantificare le dinamiche cellulari di processi biologici degli organismi viventi. IntraviImaging tal può essere effettuato tramite convenzionale eccitazione microscopia one-photon (ad esempio, confocale) o multiphoton microscopia avvicina 5. Nel corso del tempo, sostanziali miglioramenti sono stati raggiunti in questa tecnica che consente una maggiore risoluzione delle immagini, una maggiore profondità delle immagini, riduzione fotodanneggiamento del tessuto, e una maggiore 6,7 stabilizzazione delle immagini. Data la sua capacità unica di consentire la visualizzazione dinamica di migrazione cellulare e l'interazione con il tempo, la microscopia intravitale è stato ampiamente applicato a diverse aree di studio in immunologia 8. l'imaging intravitale consente immunologi di comprendere e contestualizzare le risposte immunitarie, sia a livello cellulare e molecolare in modelli animali vivere meglio.
I recenti progressi nella transgenici e knock-in topi reporter hanno fornito strumenti utili per il monitoraggio dei comportamenti dinamici di neutrofili negli animali viventi. Il lisozima M promotore-driven maggiore proteina fluorescente verde knock-ini topi sono stati ampiamente utilizzati per caratterizzare la motilità dei neutrofili, monociti e macrofagi durante i vari processi infiammatori tra cui stravaso, infezione batterica, e l'infiammazione sterile 9-15. Inoltre, i topi transgenici che esprimono una fluorescenza di risonanza di trasferimento di energia biosensore citoplasmatica sono stati impiegati nello studio delle attività di neutrofili mitogeno chinasi extracellulare-regolamentato e la proteina chinasi A all'interno dell'intestino infiammato 16. Un modello murino con alta specificità per l'espressione di fluorescenza nei neutrofili è il mouse Catchup knock-in, che produce Cre ricombinasi, nonche la tdTomato proteina fluorescente, che si è accoppiata espressione di linfociti antigene 6G (Ly6G) 17. Visualizzazione dei neutrofili Ly6G-deficienti attraverso questo modello ha dimostrato che queste cellule esercitano funzionalità normale in una varietà di contesti infiammatori vivo sterili o infettive. topi transgenici che esprimono la DsRed fluorescente protein gene sotto il controllo del mouse interleuikin-1β (IL-1β) promotore (pIL1-DsRed) sono stati utilizzati per visualizzare i comportamenti motilità delle cellule che producono IL-1b – ritenuto includere neutrofili, monociti infiammatori e macrofagi attivati - emergente in pelle infiammata 18.
In vivo etichettatura può servire come un approccio alternativo per tracciare i comportamenti cellulari e molecolari di neutrofili nei tessuti infiammati. Dopo l'iniezione endovenosa di basse dosi di fluorescente anti- Gr-1-anticorpo monoclonale (mAb), la cascata reclutamento di Gr-1 + neutrofili è stata visualizzata in lesioni cutanee topo con infezioni da Staphylococcus aureus 19. Somministrazione in vivo di coniugati contenenti streptavidina coniugati 705 nm punti quantici e biotinilato anti-Ly6G mAb etichetta specificamente neutrofili circolanti 20. Inoltre, endocitosi di tali coniugati in neutrophIL vescicole permette il monitoraggio del trasporto delle vescicole ad alta velocità nei neutrofili migrano nell'interstizio. In vivo etichettatura con anticorpi fluorescenza coniugato contro P-selectina glicoproteina ligando-1 (PSGL-1), L-selectina (CD62L), integrina αM (CD11b ) e chemochine (CXC motivo) recettore 2 (CXCR2) in un modello infiammatoria TNF-indotta ha chiarito i meccanismi di regolazione in gioco durante l'infiammazione precoce 21. neutrofili polarizzati sporgono uropodi PSGL-1-arricchito di interagire con CD62L presenti sulle piastrine attivate, con la conseguente ridistribuzione di CD11b e CXCR2, recettori che guidano la migrazione dei neutrofili e avviano l'infiammazione.
IL-1β è uno dei geni di firma che è elevata in neutrofili innescato 22. In topi reporter pIL1-DsRed, segnali di fluorescenza DsRed (es., L'attivazione del promotore di IL-1β) correlano positivamente con IL-1β mRNA espressione e la produzione di proteine di IL-1β. <sup> 18 per monitorare il processo di neutrofili adescamento, un metodo di microscopia intravitale è stato sviluppato coinvolgendo l'induzione di infiammazione della pelle con oxazolone (OX) nel modello murino pIL1-DsRed seguente etichettatura in vivo dei neutrofili con fluorescenza coniugato anti-Ly6G mAb. Attraverso questo modello, è possibile studiare il comportamento e la funzione dei neutrofili innescato in modelli animali di varie malattie e disturbi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lo scopo di questo studio è quello di sviluppare una tecnologia per il monitoraggio del processo di neutrofili adescamento in animali viventi, che non è stata ancora soddisfatte dalle tecniche attualmente disponibili. Per raggiungere questo obiettivo, tre metodologie consolidate vengono eseguiti: 1) induzione di infiammazione della pelle in topi reporter DsRed promotore-driven IL-1b come misura di priming, 2) in vivo etichettatura dei neutrofili con basse dosi di fluorescenza coniugato anti-Ly6G mAb, e 3) con…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Heparin sodium | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-540-31 | |
| ACK lysing buffer | Lonza | 10-548E | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Lipopolysaccharides | Sigma-Aldrich | L4391 | |
| Ketamine hydrochloride | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Xylazine | LLOYD Laboratory | NADA #139-236 | |
| Acepromazine | Boehringer Ingelheim | ANADA 200-361 | |
| Hair-removal cream | Church & Dwight | ||
| Acetone | Fisher Scientific | A16P4 | |
| Oxazolone | Sigma-Aldrich | E0753 | |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G antibody | BioLegend | 127610 | |
| U-100 insulin syringe with 28 G needle | BD | 329461 | |
| FITC-CM-Dextran, 150 Kda | Sigma-Aldrich | 74817 | |
| Butterfly infusion set (27 G needle) | BD | 387312 | |
| FACSCalibur cytometer | BD | ||
| CellQuest Pro software | BD | ||
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Metamorph Software | Universal Imaging |
References
- Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nat. Immunol. 15 (7), 602-611 (2014).
- Kobayashi, S. D., Voyich, J. M., Burlak, C., DeLeo, F. R. Neutrophils in the innate immune response. Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). 53 (6), 505-517 (2005).
- Condliffe, A. M., Kitchen, E., Chilvers, E. R. Neutrophil priming: pathophysiological consequences and underlying mechanisms. Clin. Sci. (Lond). 94 (5), 461-471 (1998).
- El-Benna, J., Dang, P. M., Gougerot-Pocidalo, M. A. Priming of the neutrophil NADPH oxidase activation: role of p47phox phosphorylation and NOX2 mobilization to the plasma membrane. Semin. Immunopathol. 30 (3), 279-289 (2008).
- Benson, R. A., McInnes, I. B., Brewer, J. M., Garside, P. Cellular imaging in rheumatic diseases. Nat. Rev. Rheumatol. 11 (6), 357-367 (2015).
- Herz, J., Zinselmeyer, B. H., McGavern, D. B. Two-photon imaging of microbial immunity in living tissues. Microsc. Microanal. 18 (4), 730-741 (2012).
- Tang, J., van Panhuys, N., Kastenmuller, W., Germain, R. N. The future of immunoimaging–deeper, bigger, more precise, and definitively more colorful. Eur. J. Immunol. 43 (6), 1407-1412 (2013).
- Weigert, R., Porat-Shliom, N., Amornphimoltham, P. Imaging cell biology in live animals: ready for prime time. J. Cell. Biol. 201 (7), 969-979 (2013).
- Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. J. Invest. Dermatol. 131 (10), 2058-2068 (2011).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Finsterbusch, M., Voisin, M. B., Beyrau, M., Williams, T. J., Nourshargh, S. Neutrophils recruited by chemoattractants in vivo induce microvascular plasma protein leakage through secretion of TNF. J. Exp. Med. 211 (7), 1307-1314 (2014).
- Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S inhibits neutrophil recruitment during the early stages of Streptococcus pyogenes infection. Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).
- Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain. J. Neuroinflammation. 9 (50), (2012).
- Chen, X., et al. In vivo multi-modal imaging of experimental autoimmune uveoretinitis in transgenic reporter mice reveals the dynamic nature of inflammatory changes during disease progression. J. Neuroinflammation. 12 (17), (2015).
- Slaba, I., et al. Imaging the Dynamic Platelet-Neutrophil Response in Sterile Liver Injury and Repair in Mice. Hepatology. , (2015).
- Mizuno, R., et al. In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines. J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).
- Hasenberg, A., et al. Catchup: a mouse model for imaging-based tracking and modulation of neutrophil granulocytes. Nat. Methods. 12 (5), 445-452 (2015).
- Matsushima, H., et al. Intravital imaging of IL-1beta production in skin. J. Invest. Dermatol. 130 (6), 1571-1580 (2010).
- Yipp, B. G., Kubes, P. Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo. Blood. 121 (1), 241-242 (2013).
- Kikushima, K., Kita, S., Higuchi, H. A non-invasive imaging for the in vivo tracking of high-speed vesicle transport in mouse neutrophils. Sci. Rep. 3, (1913).
- Sreeramkumar, V., et al. Neutrophils scan for activated platelets to initiate inflammation. Science. 346 (6214), 1234-1238 (2014).
- Yao, Y., et al. Neutrophil priming occurs in a sequential manner and can be visualized in living animals by monitoring IL-1beta promoter activation. J. Immunol. 194 (3), 1211-1224 (2015).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim. (NY). 34 (9), 39-43 (2005).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice). Lab. Anim. (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
- Fotos, J. S., et al. Automated time-lapse microscopy and high-resolution tracking of cell migration). Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).
- Mizumoto, N., et al. Discovery of novel immunostimulants by dendritic-cell-based functional screening. Blood. 106 (9), 3082-3089 (2005).
- Cassatella, M. A. Neutrophil-derived proteins: selling cytokines by the pound. Adv. Immunol. 73, 369-509 (1999).
- Grahames, C. B., Michel, A. D., Chessell, I. P., Humphrey, P. P. Pharmacological characterization of ATP- and LPS-induced IL-1beta release in human monocytes. Br. J. Pharmacol. 127 (8), 1915-1921 (1999).
- Levin, M., Leibrecht, H., Ryan, J., Van Dolah, F., De Guise, S. Immunomodulatory effects of domoic acid differ between in vivo and in vitro exposure in mice. Mar. Drugs. 6 (4), 636-659 (2008).
- Basu, S., Hodgson, G., Katz, M., Dunn, A. R. Evaluation of role of G-CSF in the production, survival, and release of neutrophils from bone marrow into circulation. Blood. 100 (3), 854-861 (2002).
- Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1048, 321-330 (2005).
- Zucker, R. M. Quality assessment of confocal microscopy slide-based systems: instability. Cytometry A. 69 (7), 677-690 (2006).
- Hogan, H. Focusing on the experiment. Biophotonics. Int. 13, 48-51 (2006).
- Kabashima, K., Egawa, G. Intravital multiphoton imaging of cutaneous immune responses. J. Invest. Dermatol. 134 (11), 2680-2684 (2014).
- Egawa, G., Natsuaki, Y., Miyachi, Y., Kabashima, K. Three-dimensional imaging of epidermal keratinocytes and dermal vasculatures using two-photon microscopy. J. Dermatol. Sci. 70 (2), 143-145 (2013).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nat. Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A method for 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window. J. Vis. Exp. (12), (2008).
- Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nat. Protoc. 8 (3), 583-594 (2013).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat. Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
