IL-1β의 발기인 기반을 DsRed 기자 마우스를 사용 호중구 초벌의 생체 내에 영상
Summary
This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.
Abstract
호중구는 인간의 혈액 순환에서 가장 풍부한 백혈구하고 신속하게 염증 사이트에 채용된다. 초벌은 중성 백혈구의 식세포 기능을 향상시키는 중요한 이벤트입니다. 광범위한 연구는 감염과 부상 중에 존재와 호중구 프라이밍의 중요성을 발표했지만, 사용할 수 있었다 생체 내에서이 과정을 시각화의 의미합니다. 형광 접합 된 항 – 림프구 항원을 주입함으로써 달성 – 2) 생체 호중구 라벨링 프라이밍의 척도로 사용 – 1)을 DsRed 리포터 신호는 제공된 프로토콜은 세 가지 방법을 조합함으로써 살아있는 동물에서 프라이밍 호중구의 동적 프로세스의 모니터링을 가능하게 6G (Ly6G) 단일 클론 항체 (단클론 항체), 3) 생체 내에 공 촛점 이미징. 몇 가지 중요한 단계는이 프로토콜에 관련된 : 옥사 졸론 유발 마우스 귀 피부 염증, 동물의 적절한 진정 작용, 항 Ly6G 단클론 항체의 반복 주사 및 이전을촬영시 초점 드리프트의 ention. 몇 가지 제한이 그러한 한 마우스에서의 연속 촬영 시간 (~ 8 시간)의 한계 및 형광 염료 덱스 트란 염증 상태의 혈관에서의 누설로 관찰되었지만,이 프로토콜의 생체 내에 이미징을위한 기본 틀을 제공한다 쉽게 마우스 염증 모델에서 다른 면역 세포의 검토로 확장 될 수 프라임 호중구 동작 및 기능.
Introduction
호중구는 순환에서 가장 풍부하고 단명 한 백혈구 수 있습니다. 그들은 신속하게 그들이 항균 펩타이드 및 단백질 분해 효소 1을 포함하는 과립과 함께 활성 산소와 질소 중간체의 출시를 통해 같은 전문 식세포를 제공 감염이나 부상의 사이트에 채용된다. 그들의 채용 동안 호중구 염증 (2)의 위치에 도착하면 현저하게 향상 식세포 기능의 결과로, 미생물 제품, 화학 유인 물질 및 염증성 사이토킨을 포함하는 다양한 에이전트 "프라이밍"된다. 호중구 프라이밍 메커니즘은 광범위하게 연구 시험 관내 3,4-되었다; 그러나, 생체 내에서 처리를 동적으로 모니터링은 현재까지 불가능 하였다.
최근 생체 내에 영상은 시각화 및 생물에 생물학적 과정의 세포 역학을 정량화하기위한 중요한 기술이되고있다. Intravi탈 촬상는 종래의 광자 현미경 여기를 통해 (예를 들어, 공 초점)을 수행하거나 다 광자 현미경 (5)에 접근 할 수있다. 시간이 지남에 상당한 개선이 증가 영상 해상도 개선 촬상 깊이를 가능하게이 기술에서 달성되어, 광 손상 조직, 향상된 이미지 안정화 -6,7- 감소. 시간이 지남에 따라 세포 마이그레이션 및 상호 작용의 동적 시각화를 가능하게하는 독특한 능력을 감안할 때, 생체 내에 현미경 광범위 면역학 8 연구의 다양한 분야에 적용되고있다. 생체 내에 영상은 더 잘 이해하고 동물 모델 생활에서 모두 세포 및 분자 수준에서 면역 반응을 상황화하는 면역 학자 수 있습니다.
최근 유전자 변형의 발전뿐만 아니라 노크에서 기자 마우스 등 살아있는 동물에서 호중구의 동적 행동을 모니터링하기위한 유용한 도구를 제공하고 있습니다. 라이소자임 M 프로모터 기반의 강화 된 녹색 형광 단백질 노크에서생쥐는 크게 넘쳐, 세균 감염 및 염증 멸균 9-15 포함한 다양한 염증 과정 동안 호중구, 단핵구 및 대 식세포의 운동성을 특성화하는데 사용되어왔다. 또한, 세포질 형광 공명 에너지 전달, 바이오 센서를 발현하는 형질 전환 마우스는 염증 부위 내에 16 호중구 세포 미토 겐 – 조절 키나아제 및 단백질 키나아제 A의 활동을 연구에 사용되었다. 호중구의 형광 발현 특이성을 가진 쥐 모델 자체 림프구 항원 6G (Ly6G) (17) 식으로 결합되는 형광 단백질 tdTomato,뿐만 아니라 Cre 호텔 재조합 효소를 생산시 Catchup 녹아웃 마우스이다. 이 모델을 통해 Ly6G 결핍 호중구의 시각화는 이러한 세포에서 멸균 또는 감염성 생체 내 염증 다양한 상황에서 정상적인 기능을 발휘 있음을 보여 주었다. 을 DsRed 형광 페이지를 발현하는 형질 전환 마우스호중구 염증 단핵구 활성화 대 식세포를 포함 할 것으로 – – (IL-1β) 프로모터 (pIL1-을 DsRed)는 IL-1β 생산 세포의 운동성 동작을 시각화하는데 이용 된 interleuikin-1β 마우스의 제어하에 유전자 rotein 신흥 염증이 피부 십팔인치
생체 내에서 라벨은 염증 조직에서 호중구의 세포 및 분자 행동을 추적하는 또 다른 방법이 될 수 있습니다. 안티 GR-1 단일 클론 항체 (단클론 항체) 라벨 형광의 낮은 용량의 정맥 주사, GR-1 + 호중구의 모집 캐스케이드 후 황색 포도상 구균 (19)에 감염된 마우스의 피부 병변에 가시화되고있다. streptavidin-를 포함하는 복합체의 생체 내 투여 결합 705 nm의 양자점과 바이오틴 안티 Ly6G 단클론 항체는 특히 순환 호중구 (20) 레이블을 붙입니다. neutroph에 이러한 접합체 또한, 엔도 시토 시스IL 소체는 간질로 이주 호중구 고속 소낭 수송의 추적을 허용한다. 생체 P- 셀렉틴 대 형광 복합 항체 αM 인테그린 리간드 -1 (PSGL-1), L 셀렉틴 (CD62L)을 당 단백질로 표지 (는 CD11b를 TNFα에 의한 염증 모델)과 케모카인 (CXC 모티브) 수용체 2 (CXCR2)는 초기 염증 21시 놀이 규제 메커니즘을 해명했다. 편광 호중구는 CD11b를하고 CXCR2, 호중구의 이동을 유도하고 염증을 시작 수용체의 재분배 결과, 활성화 된 혈소판에서 CD62L 존재와 상호 작용하는 uropods을 PSGL-1이 풍부한 돌출.
IL-1β는 준비하는 호중구 (22)에 상승 서명 유전자 중 하나입니다. pIL1-을 DsRed 기자 마우스에서,을 DsRed 형광 신호 (예., IL-1β의 프로모터의 활성화) 긍정적으로 mRNA 발현과 IL-1β 단백질 생산 IL-1β와 상관 관계. <SUP> 18 호중구 프라이밍의 프로세스를 모니터링하기 위해, 생체 내에 현미경 방법은 형광 접합 된 항 Ly6G 단클론 항체와 호중구의 생체 표지 다음 pIL1-을 DsRed 마우스 모델에서 옥사 졸론 (OX)와 피부 염증의 유도를 포함하는 개발되었다. 이 모델을 통해 다양한 질병과 질환의 동물 모델에서 호중구 뇌관의 동작 및 기능을 연구 할 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 연구의 목적은 아직 현재의 기술에 의해 실현되지 않은 살아있는 동물의 호중구 프라이밍의 과정을 모니터링하는 기술을 개발하는 것이다. 이 목표를 달성하기 위해 세 가지 설정 방법이 수행됩니다 : 피부 염증의 1) 유도 IL-1β 프로모터 기반을 DsRed 기자 마우스에서 프라이밍의 측정, 형광 접합 된 항 Ly6G의 낮은 복용량으로 호중구의 2) 생체 표지로 단클론 항체, 3) 생체 내에 공 촛점 현?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Heparin sodium | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-540-31 | |
| ACK lysing buffer | Lonza | 10-548E | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Lipopolysaccharides | Sigma-Aldrich | L4391 | |
| Ketamine hydrochloride | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Xylazine | LLOYD Laboratory | NADA #139-236 | |
| Acepromazine | Boehringer Ingelheim | ANADA 200-361 | |
| Hair-removal cream | Church & Dwight | ||
| Acetone | Fisher Scientific | A16P4 | |
| Oxazolone | Sigma-Aldrich | E0753 | |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G antibody | BioLegend | 127610 | |
| U-100 insulin syringe with 28 G needle | BD | 329461 | |
| FITC-CM-Dextran, 150 Kda | Sigma-Aldrich | 74817 | |
| Butterfly infusion set (27 G needle) | BD | 387312 | |
| FACSCalibur cytometer | BD | ||
| CellQuest Pro software | BD | ||
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Metamorph Software | Universal Imaging |
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