Imaging intravital de neutrófilos Cebado El uso de IL-1 promotor impulsado reportero ratones DsRed
Summary
This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.
Abstract
Los neutrófilos son los leucocitos más abundantes en la circulación de la sangre humana y son reclutados rápidamente a los sitios inflamatorios. El cebado es un evento crítico que mejora la funcionalidad fagocítica de los neutrófilos. A pesar de extensos estudios han revelado la existencia y la importancia de cebado de neutrófilos durante la infección y las lesiones, los medios de visualización de este proceso in vivo no han estado disponibles. El protocolo proporcionado permite la monitorización del proceso dinámico de neutrófilos cebado en animales vivos mediante la combinación de tres metodologías: 1) la señal del informador DsRed – se utiliza como una medida de cebado 2) etiquetado de neutrófilos in vivo – logrado por la inyección de antígeno anti-linfocitos fluorescencia conjugado 6G (Ly6G) anticuerpo monoclonal (mAb) y 3) la imagen confocal intravital. Varios pasos críticos están involucrados en este protocolo: la inflamación inducida por oxazolona piel de oreja de ratón, la sedación adecuada de los animales, las inyecciones repetidas de anticuerpos anti-Ly6G mAb, y prevención de la deriva de enfoque durante la exploración. Aunque se han observado algunas limitaciones, tales como el límite de tiempo de imagen continua (~ 8 horas) en un ratón y la fuga de isotiocianato-dextrano de los vasos sanguíneos en el estado inflamatorio de fluoresceína, este protocolo ofrece un marco fundamental para intravital de imágenes de comportamiento imprimada de neutrófilos y la función, que puede ser fácilmente ampliado para examen de otras células inmunes en modelos de inflamación de ratón.
Introduction
Los neutrófilos son los leucocitos más abundantes y de corta duración en la circulación. Ellos son reclutados rápidamente a los sitios de infección o lesión, donde sirven como fagocitos profesionales a través de la liberación de oxígeno y nitrógeno intermedios reactivos, junto con gránulos que contienen péptidos antimicrobianos y proteasas 1. Durante su reclutamiento, los neutrófilos están "preparados" por varios agentes, incluidos los productos microbianos, factores quimiotácticos y citoquinas inflamatorias, lo que resulta en la funcionalidad de los fagocitos marcadamente mejorada al llegar a un sitio de la inflamación 2. Los mecanismos de cebado de neutrófilos han sido ampliamente estudiados in vitro 3,4; Sin embargo, el seguimiento dinámico del proceso in vivo no ha sido posible hasta la fecha.
Recientemente, intravital de imágenes se ha convertido en una técnica importante para la visualización y la cuantificación de la dinámica celular de los procesos biológicos en los organismos vivos. Intravide formación de imágenes tal se puede realizar a través de microscopía de excitación de un solo fotón convencionales (por ejemplo, confocal) o microscopía multifotónica se aproxima a 5. Con el tiempo, las mejoras sustanciales se han logrado en esta técnica que permite aumentar la resolución de la imagen, la mejora de la profundidad de formación de imágenes, disminución de fotodaño del tejido, y el aumento de 6,7 estabilización de imagen. Dada su capacidad única para permitir la visualización dinámica de la migración celular y la interacción con el tiempo, la microscopía intravital se ha aplicado ampliamente a diversos campos de estudio de la inmunología 8. intravital de imágenes permite a los inmunólogos para comprender mejor y contextualizar la respuesta inmune, tanto a nivel celular y molecular en modelos animales que viven.
Los recientes avances en transgénicos, así como en ratones knock-informadores han proporcionado herramientas útiles para el seguimiento de los comportamientos dinámicos de neutrófilos en los animales vivos. La lisozima M promotor impulsado por una mayor proteína verde fluorescente knock-inlos ratones se han utilizado ampliamente para caracterizar la motilidad de los neutrófilos, monocitos y macrófagos durante diversos procesos inflamatorios, incluyendo la extravasación, infección bacteriana, y la inflamación estéril 9-15. Además, los ratones transgénicos que expresan un biosensor de resonancia de fluorescencia la transferencia de energía citoplásmica se han empleado en el estudio de las actividades de los neutrófilos mitógeno quinasa extracelular regulada y la proteína quinasa A dentro de intestino inflamado 16. Un modelo murino con una alta especificidad para la expresión de la fluorescencia de los neutrófilos es el ratón knock-in Catchup, que produce la recombinasa Cre, así como la tdTomato proteína fluorescente, que a su vez está acoplado a la expresión de antígeno de linfocitos 6G (Ly6G) 17. La visualización de los neutrófilos Ly6G deficientes a través de este modelo ha demostrado que estas células ejercen funcionalidad normal en una variedad de contextos inflamatorios in vivo estériles o infecciosas en. Los ratones transgénicos que expresan la DsRed fluorescente protein gen bajo el control del ratón interleuikin-1β (IL-1β) promotor (pIL1-DsRed) han sido utilizados para visualizar los comportamientos móviles de células productoras de IL-1ß – cree incluyen neutrófilos, monocitos inflamatorios, y macrófagos activados – emergente en la piel inflamada 18.
In vivo etiquetado puede servir como un enfoque alternativo para el seguimiento de los comportamientos celulares y moleculares de los neutrófilos en los tejidos inflamados. Después de la inyección intravenosa de bajas dosis de etiqueta fluorescente-1 anti-Gr anticuerpo monoclonal (mAb), la cascada de reclutamiento de Gr-1 + neutrófilos ha sido visualizado en las lesiones de piel de ratón infectadas con Staphylococcus aureus 19. La administración in vivo de conjugados que contienen estreptavidina conjugados 705 puntos cuánticos nm y biotina anti-Ly6G mAb etiquetan específicamente neutrófilos circulantes 20. Por otra parte, la endocitosis de tales conjugados en neutrophil vesículas permite el seguimiento de la vesícula de transporte de alta velocidad en los neutrófilos que migran hacia el intersticio. In vivo etiquetado con anticuerpos de fluorescencia conjugada contra P-selectina glicoproteína ligando-1 (PSGL-1), L-selectina (CD62L), la integrina αM (CD11b ) y quimiocinas (CXC motivo) del receptor 2 (CXCR2) en un modelo inflamatoria TNF inducida ha dilucidado los mecanismos de regulación en juego durante la inflamación temprana 21. neutrófilos polarizadas sobresalen urópodos PSGL-1-enriquecido para interactuar con CD62L presente en las plaquetas activadas, lo que resulta en la redistribución de CD11b y CXCR2, los receptores que dirigen la migración de neutrófilos e inician la inflamación.
IL-1β es uno de los genes de la firma que se encuentra elevado en los neutrófilos imprimados 22. En los ratones reportero pIL1-DsRed, las señales de fluorescencia DsRed (es decir., La activación del promotor de la IL-1β) se correlacionan positivamente con la IL-1β la expresión del ARNm y la producción de la proteína IL-1β. <sup> 18 para supervisar el proceso de cebado de neutrófilos, se ha desarrollado un método de microscopía intravital que implica la inducción de la inflamación de la piel con oxazolona (OX) en el modelo de ratón pIL1-DsRed siguiente etiquetado in vivo de los neutrófilos con anti-Ly6G mAb conjugados con fluoresceína. A través de este modelo, es posible estudiar el comportamiento y la función de los neutrófilos imprimadas en modelos animales de diversas enfermedades y trastornos.
Protocol
Representative Results
Discussion
El objetivo de este estudio es desarrollar una tecnología para el seguimiento del proceso de cebado de neutrófilos en los animales vivos, que aún no ha sido cumplido por las técnicas disponibles en la actualidad. Para lograr este objetivo, se realizan tres metodologías establecidas: 1) la inducción de la inflamación de la piel en ratones reportero DsRed promotor impulsado por IL-1 como una medida de cebado, 2) etiquetado in vivo de los neutrófilos con dosis bajas de fluorescencia de conjugado anti-Ly6G …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Heparin sodium | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-540-31 | |
| ACK lysing buffer | Lonza | 10-548E | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Lipopolysaccharides | Sigma-Aldrich | L4391 | |
| Ketamine hydrochloride | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Xylazine | LLOYD Laboratory | NADA #139-236 | |
| Acepromazine | Boehringer Ingelheim | ANADA 200-361 | |
| Hair-removal cream | Church & Dwight | ||
| Acetone | Fisher Scientific | A16P4 | |
| Oxazolone | Sigma-Aldrich | E0753 | |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G antibody | BioLegend | 127610 | |
| U-100 insulin syringe with 28 G needle | BD | 329461 | |
| FITC-CM-Dextran, 150 Kda | Sigma-Aldrich | 74817 | |
| Butterfly infusion set (27 G needle) | BD | 387312 | |
| FACSCalibur cytometer | BD | ||
| CellQuest Pro software | BD | ||
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Metamorph Software | Universal Imaging |
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