诱导多能干细胞使用成纤维样滑膜生成类风湿关节炎患者的关节分离
Summary
在这里，我们描述了从患者来源的成纤维细胞样滑膜细胞产生的诱导的人多能干细胞，使用慢病毒系统无饲养细胞的协议。
Abstract
成熟的体细胞可以使用一组已定义的重编程因子被逆转成多潜能干细胞样的状态。的Oct4，Sox2的，Klf4的和c-Myc：大量的研究已经通过转导4山中转录因子产生的各种体细胞类型的诱导多能干细胞（iPS细胞）。 iPS细胞的研究仍然是生物学和临床研究的前沿。特别是，患者特异性iPSCs的可以被用作疾病病理学的研究开拓工具，因为iPSCs的可以从任何个体的组织进行诱导。类风湿关节炎（RA）是一种慢性炎性疾病，软骨和骨结构中的关节的破坏分类。滑膜增生是导致这些结果在RA中的主要原因或症状之一。成纤维细胞样滑膜细胞（FLSS）是在增生的滑膜的主要成分的细胞。 FLSS在合资无限增殖，最终侵入相邻cartil年龄和骨骼。目前，增生性滑膜只能通过外科手术去除。移除的滑膜用于RA的研究作为反映关节的炎性病症的材料。如在RA的发病机理的主要参与者，FLSS可用作一种材料，以产生并调查RA患者的iPSCs的。在这项研究中，我们使用了RA患者的FLSS产生的iPSC。使用慢病毒系统，我们发现FLSS可以生成RA患者特异性的iPSC。从FLSS产生的iPS细胞可以进一步用来作为一种工具来研究RA的病理生理的未来。
Introduction
多能性干细胞是在不同的临床和生物领域的下一代平台。它们是一种很有前途的工具，可以在疾病建模，药物筛选，并再生医疗治疗中使用。人类胚胎干细胞（胚胎干细胞）主要用于研究和理解多能细胞。然而，由人胚泡的破坏分离，人类胚胎干细胞与几个伦理问题相关联。 2007年，山中伸弥博士和他的团队逆转细胞编程过程和成人的体细胞1,2开发干细胞。因此，与人类胚胎干细胞，诱导多能干细胞（iPS细胞），可以从成熟的体细胞中产生，避免了伦理障碍。
的Oct4，Sox2的，Klf4和c-Myc的：通常，由四个外源基因递送产生的iPSC。这些因素山中正在使用慢病毒和逆转录病毒系统最初交付。第一iPS细胞是从鼠体细胞衍生Ç厄尔3。然后，将技术应用于人皮肤成纤维1,2。随后的研究成功生成从各种来源，如尿4，血液5,6- iPSCs的，角质7和其他一些类型的细胞。然而，也有没有在重新编程中使用的一些体细胞，并从在疾病状态特异组织的各种细胞类型的重新编程能力筛选，仍然需要。
类风湿关节炎（RA）是一种可以攻击所有关节，并导致在其他器官自身免疫疾病的疾病。 RA影响在发达国家成年人约1％。这是一种相当常见的疾病和其发病率逐年增加8。然而，RA是很难在早期识别和摧毁oncebone发生没有治疗，可以恢复的损害。此外，药物的功效，从患者的不同而不同病人，这是很难预测的军医所需INE。因此，药物筛选方法的开发是必要的，并且需要能反映RA的条件的细胞的材料。
成纤维样滑膜（FLSS）均在9,10 RA发病的积极参与者的细胞。 FLSS在关节囊和腔，其也被称为滑膜之间滑膜内膜衬里存在。通过支持接头结构和周围软骨提供营养，FLSS通常发挥关节功能和维护了至关重要的作用。然而，在FLSS RA具有侵入性的表型。 RA FLSS有一个肿瘤样表型，最终被无限增殖10摧毁了周围的骨骼。这种独特的特性，FLSS可以用作一个有前途的材料，可反映RA的病理生物学。然而，这些细胞很少产生，细胞表型改变的细胞经过在体外几段</eM>的条件。因此，它可以使用复杂的RA FLSS作为一种工具，可以代表病人的状况。
从理论上讲，RA患者来源的iPS细胞（RA-iPSCs的），可以成为药物筛选和进一步研究的理想工具。产生的iPSC具有自我更新的能力，并且可以保持和体外扩展。与多能性，这些细胞可以分化为成熟软骨细胞和骨细胞谱系，其可为在RA和其它骨相关疾病11具体的研究有助于细胞材料。
在这项研究中，我们将演示如何隔离和从手术切除滑膜，以及如何扩大FLSS使用含有山因素慢病毒从FLSS产生RA-iPSCs的。
Protocol
Representative Results
Discussion
iPS细胞的发现之前，科学家主要用于胚胎干细胞通过差异化来研究干细胞生物学和其他细胞系。然而，胚胎干细胞从胚泡，这是一个早期胚胎的内质起源。为了分离胚胎干细胞，囊胚破坏是不可避免的，提高是不可能克服的伦理问题。此外，尽管胚胎干细胞具有干性特征和多能性，它们不能从个体获得的，并且有时不进行个性化的分析和疾病筛查的理想工具。
在2007年，高桥…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Research Program funded by the Korea Centers for Disease Control and Prevention (HI13D2188).
Materials
| 100mm Dish | TPP | 93100 | |
| 6-well Plate | TPP | 92006 | |
| 50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| 12-well Plate | TPP | 92012 | |
| FLS Isolation Materials | |||
| Surgical Scissors | |||
| Surgical Forcep | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-073 | |
| Penicilin Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | |
| Collagenase | Sigma Aldrich | C6885-100MG | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | 54956 | |
| PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| iPSC Generation Materials | |||
| DMEM | Life Technologies | 11885 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003-G | |
| Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Lentivirus | |||
| DMEM/F12, HEPES | Life Technologies | 11330-057 | iPSC media ingredient (500 mL) |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080-094 | iPSC media ingredient (Conc.: 543 μg/mL) |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | iPSC media ingredient (Conc.: 14 ng/mL) |
| Human Transfferin | Sigma Aldrich | T3705 | iPSC media ingredient (Conc.: 10.7 μg/mL) |
| Basic FGF2 | Peprotech | 100-18B | iPSC media ingredient (Conc.: 100 ng/mL) |
| Human Insulin | Life Technologies | 12585-014 | iPSC media ingredient (Conc.: 20 μg/mL) |
| Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | iPSC media ingredient (Conc.: 2 ng/mL) |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A8960 | iPSC media ingredient (Conc.: 64 μg/mL) |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| Vitronectin | Life Technologies | A14700 | |
| ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Guality Control Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| Anti-Oct4 Antibody | Santa Cruz | SC9081 | |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4360 | |
| Anti-Sox2 Antibody | Biolegend | 630801 | |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Millipore | MAB4381 | |
| Anti-Klf4 Antibody | Abcam | ab151733 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11037 | |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10X TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Alkaline Phosphatase | Millipore | SCR004 |
References
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