Generation af induceret-pluripotente stamceller Brug fibroblastlignende synoviocytter Isoleret fra leddene på leddegigt patienter

Summary

Her beskriver vi en protokol til generering humane induceret pluripotente stamceller fra patient-afledt fibroblastlignende synoviocytter, ved anvendelse af en lentiviral system uden fødeceller.

Abstract

Modne somatiske celler kan vendes i en pluripotent stamcelle-lignende tilstand under anvendelse af et defineret sæt af omprogrammering faktorer. Talrige undersøgelser har genereret induceret-pluripotente stamceller (iPSCs) fra forskellige somatiske celletyper ved at transducere fire Yamanaka transkriptionsfaktorer: Oct4, Sox2, Klf4 og c-myc. Studiet af iPSCs forbliver på forkant med biologisk og klinisk forskning. Især kan patientspecifikke iPSCs anvendes som et banebrydende redskab til studiet af sygdom Patobiologi, eftersom iPSCs kan induceres fra vævet af en enkeltperson. Leddegigt (RA) er en kronisk inflammatorisk sygdom, klassificeret af ødelæggelse af brusk og knogle struktur i leddet. Synovial hyperplasi er en af ​​de vigtigste årsager eller symptomer, der fører til disse resultater i RA. Fibroblastlignende synoviocytter (FLSs) er de vigtigste elementer celler i hyperplastisk synovium. FLSs i leddet limitlessly formere sig, efterhånden invaderer den tilstødende cartilalder og knogle. I øjeblikket kan det hyperplastiske synovium kun fjernes ved et kirurgisk indgreb. Det fjernede synovium anvendes til RA forskning som et materiale, der reflekterer den inflammatoriske tilstand af samlingen. Som en vigtig spiller i patogenesen af ​​RA, kan FLSs anvendes som et materiale til at generere og undersøge iPSCs af RA-patienter. I denne undersøgelse, brugte vi FLSs af en RA patient at generere iPSCs. Ved hjælp af en lentiviral-system, opdagede vi, at FLSs kan generere RA patient-specifikke iPSC. De iPSCs genereres fra FLSs kan yderligere anvendes som et redskab til at studere patofysiologien af ​​RA i fremtiden.

Introduction

Pluripotente stamceller er den næste generation platform i forskellige kliniske og biologiske område. De er et lovende redskab, der kan anvendes i sygdomsmodeller, drug screening, og regenerativ medicinsk terapi. Humane embryonale stamceller (hESCs) blev primært brugt til at studere og forstå pluripotente celler. Imidlertid isoleret ved ødelæggelse af den menneskelige blastocyst, er hESCs forbundet med flere etiske overvejelser. I 2007 Dr. Shinya Yamanaka og hans team vendt cellen programmeringsprocessen og udviklet stamceller fra menneskelige voksne somatiske celler ^1,2. Derfor, i modsætning hESCs, inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) kan genereres fra modne somatiske celler, så man undgår de etiske forhindringer.

Normalt er iPSCs genereres af levering af fire eksogene gener: Oct4, Sox2, Klf4, og c-myc. Disse Yamanaka faktorer er oprindeligt leveres ved hjælp lentivirale og retrovirale systemer. De første iPSCs blev afledt fra muse somatisk calen ^3. Bagefter blev teknikken i humane dermale fibroblaster ^1,2. Efterfølgende undersøgelser held genereret iPSCs fra forskellige kilder, såsom urin ^4, blod ^5,6, keratinocytter ^7, og flere andre celletyper. Der er dog nogle somatiske celler, der ikke er blevet anvendt i omprogrammering samt screening af omprogrammering kapaciteter af forskellige celletyper fra specifikke væv i sygdomstilstanden, stadig er nødvendig.

Rheumatoid arthritis (RA) er en sygdom, der kan ramme alle samlinger og føre til autoimmune tilstande i andre organer. RA påvirker omkring 1% af voksne i den udviklede verden. Det er en temmelig almindelig sygdom og forekomsten stiger hvert år ^8. Men RA er svært at identificere i de tidlige stadier og oncebone ødelæggelse opstår der ingen behandling, der kan genvinde skaden. Endvidere lægemiddeleffektivitet forskellig fra patient til patient, og det er svært at forudsige lægeine der er påkrævet. Derfor er der behov for udviklingen af ​​et lægemiddel-screeningsmetode, og en celle materiale, der kan afspejle betingelserne i RA er påkrævet.

Fibroblastlignende synoviocytter (FLSs) er en aktiv cellulær deltager i patogenesen af RA ^9,10. FLSs findes i synovial intimal foring mellem ledkapslen og hulrum, som også omtales som synovium. Ved at støtte fælles struktur og tilvejebringelse næringsstoffer til det omgivende brusk, FLSs spille sædvanligvis en afgørende rolle i ledfunktion og vedligeholdelse. Imidlertid FLSs i RA har en invasiv fænotype. RA FLSs har en cancer-lignende fænotype, vinder ødelægge den omgivende knogle ved uendelig proliferation ^10. Med denne unikke egenskab, kan FLSs anvendes som et lovende materiale, der kan afspejle patobiologien af ​​RA. Alligevel er disse celler sjældent producerede, og cellefænotyper ændre, som cellerne gå gennem flere passager i in vitro </eM> forhold. Derfor kan det være kompliceret at anvende RA FLSs som et værktøj, der kan repræsentere patientens tilstand.

Teoretisk set kan RA patient-afledte iPSCs (RA-iPSCs) blevet et ideelt værktøj til screening narkotika og yderligere forskning. Genereret iPSCs har selvfornyelse evne og kan fastholdes og udbygges i vitro. Med pluripotens, kan disse celler differentieres til modne chondrocyt og osteocyt slægter, som kan bidrage cellemateriale for specifik forskning i RA og andre knogle sygdomme ^11.

I denne undersøgelse, viser vi, hvordan man isolerer og udvide FLSs fra et kirurgisk fjernet synovium, og hvordan man kan generere RA-iPSCs fra FLSs hjælp lentivirus indeholder Yamanaka faktorer.

Protocol

Etik Statement: Denne undersøgelse protokol blev godkendt af institutionelle gennemgang bestyrelse det katolske universitet i Korea (KC12TISI0861). 1. synoviocyt Isolering og Udvidelse synoviocyt Isolation Sterilisere to par kirurgiske sakse og en tang. Overfør synovialvævet til en 100 mm skål og vask med 5 ml phosphatbufret saltvand (PBS) indeholdende 1% penicillin / streptomycin. Skær gullige fedt væv og knogler rester. Overfør det trimmede væv til en brønd af e…

Representative Results

I denne undersøgelse beskriver vi en protokol til at generere iPSCs fra FLSs ved hjælp af et lentiviral system. Figur 1A viser et simpelt arrangement med FLS isolation protokollen. Efter kirurgisk fjernelse af synovium blev vævet hakket i små stykker med kirurgiske sakse. Collagenase blev tilsat for at isolere cellerne fra klumper af væv. Cellerne blev inkuberet i 14 dage før yderligere behandling. Figur 1B viser morfologi isolered…

Discussion

Før opdagelsen af ​​iPSCs, videnskabsfolk hovedsagelig anvendes sektorråd at studere stamcellebiologi og andre cellelinier gennem differentiering. Men ØSR stammer fra den indre masse af en blastocyst, som er et tidligt stadie foster. For at isolere økonomiske og sociale råd, ødelæggelse af blastocyst er uundgåelig, hæve etiske spørgsmål, der er umulige at overvinde. Selv om økonomiske og sociale råd har stemness egenskaber og pluripotens, de kan ikke tappes fra personer og er nogle gange ikke et ideelt …

Materials

100mm Dish	TPP	93100
6-well Plate	TPP	92006
50 mL Cornical Tube	SPL	50050
15 mL Cornical Tube	SPL	50015
10 mL Disposable Pipette	Falcon	7551
5 mL Disposable Pipette	Falcon	7543
12-well Plate	TPP	92012
FLS Isolation Materials
Surgical Scissors
Surgical Forcep
DPBS	Life Technologies	14190-144
DMEM	Life Technologies	11995-073
Penicilin Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	16000-044
Collagenase	Sigma Aldrich	C6885-100MG
Parafilm	Sigma Aldrich	54956
PBS/1 mM EDTA	Life Technologies	12604-039
iPSC Generation Materials
DMEM	Life Technologies	11885
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Life Technologies	11140-050
β-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148
Polybrene	Chemicon	TR-1003-G
Penicilin Streptomycin	Life Technologies	P4333
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	16000-044
DPBS	Life Technologies	14190-144
Lentivirus
DMEM/F12, HEPES	Life Technologies	11330-057	iPSC media ingredient (500 mL)
Sodium Bicarbonate	Life Technologies	25080-094	iPSC media ingredient (Conc.: 543 μg/mL)
Sodium Selenite	Sigma Aldrich	S5261	iPSC media ingredient  (Conc.: 14 ng/mL)
Human Transfferin	Sigma Aldrich	T3705	iPSC media ingredient (Conc.: 10.7 μg/mL)
Basic FGF2	Peprotech	100-18B	iPSC media ingredient  (Conc.: 100 ng/mL)
Human Insulin	Life Technologies	12585-014	iPSC media ingredient (Conc.: 20 μg/mL)
Human TGFβ1	Peprotech	100-21	iPSC media ingredient (Conc.: 2 ng/mL)
Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A8960	iPSC media ingredient  (Conc.: 64 μg/mL)
Polybrene	Chemicon	TR-1003
Sodium Butyrate	Sigma Aldrich	B5887
Vitronectin	Life Technologies	A14700
ROCK Inhibitor	Sigma Aldrich	Y0503
Guality Control Materials
18 mm Cover Glass	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innovation	BPP-9004
Triton X-100	BIOSESANG	9002-93-1
Bovine Serum Albumin	Vector Lab	SP-5050
Anti-SSEA4 Antibody	Millipore	MAB4304
Anti-Oct4 Antibody	Santa Cruz	SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody	Millipore	MAB4360
Anti-Sox2 Antibody	Biolegend	630801
Anti-TRA-1-81 Antibody	Millipore	MAB4381
Anti-Klf4 Antibody	Abcam	ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11037
DAPI	Molecular Probe	D1306
Prolong gold antifade reagent	Invitrogen	P36934
Slide Glass, Coated	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroform	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore	109634
Ethanol	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit	Thermo Scientfic	K1622
i-Taq DNA Polymerase	iNtRON BIOTECH	25021
UltraPure 10X TBE Buffer	Life Technologies	15581-044
loading star	Dyne Bio	A750
Agarose	Sigma-Aldrich	9012-36-6
1kb (+) DNA ladder marker	Enzynomics	DM003
Alkaline Phosphatase	Millipore	SCR004