Génération de cellules souches induites pluripotentes Utilisation synoviocytes fibroblaste Isolé Joints de la polyarthrite rhumatoïde Les patients

Résumé

Nous décrivons ici un protocole destiné à générer des cellules souches pluripotentes humaines induites par les synoviocytes de type fibroblaste provenant de patients, en utilisant un système lentiviral sans cellules nourricières.

Résumé

cellules somatiques matures peuvent être inversées dans un état de cellules souches pluripotentes comme l'aide d'un ensemble défini de facteurs de reprogrammation. De nombreuses études ont généré induites-cellules souches pluripotentes (CISP) à partir de différents types de cellules somatiques par transduction quatre Yamanaka facteurs de transcription: Oct4, Sox2, Klf4 et c-Myc. L'étude des CSPi demeure à la fine pointe de la recherche biologique et clinique. En particulier, CSPi spécifiques au patient peuvent être utilisés comme un outil d'avant-garde pour l'étude de pathobiologie de la maladie, puisque CSPi peuvent être induites à partir du tissu de tout individu. La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie inflammatoire chronique, classé par la destruction du cartilage et la structure de l'os dans l'articulation. hyperplasie synoviale est une des raisons majeures ou des symptômes qui conduisent à ces résultats dans la polyarthrite rhumatoïde. Synoviocytes fibroblast-like (SSLF) sont les principales cellules du composant dans la synoviale hyperplasique. FLSS dans l'articulation prolifèrent indéfiniment, finalement envahir le cartil adjacentl'âge et de l'os. À l'heure actuelle, la synoviale hyperplasique peut être enlevé que par une intervention chirurgicale. La membrane synoviale enlevée est utilisée pour la recherche RA comme un matériau qui reflète l'état inflammatoire de l'articulation. En tant qu'acteur majeur dans la pathogenèse de la PR, FLSS peut être utilisé comme un matériau pour générer et étudier les CSPi de patients atteints de PR. Dans cette étude, nous avons utilisé le FLSS d'un patient atteint de PR pour générer CSPi. En utilisant un système lentiviral, nous avons découvert que FLSS peut générer RA spécifique au patient iPSC. Les CSPi générées par FLSS peuvent encore être utilisés comme un outil pour étudier la physiopathologie de la PR dans le futur.

Introduction

Les cellules souches pluripotentes sont la plate-forme de nouvelle génération dans divers domaines cliniques et biologiques. Ils sont un outil prometteur qui peut être utilisé dans la modélisation de la maladie, le dépistage des drogues, et le traitement médical régénérateur. Humaines cellules souches embryonnaires (CSEh) ont été principalement utilisés pour étudier et comprendre les cellules pluripotentes. Cependant, isolé par la destruction du blastocyste humain, CSEh sont associés à plusieurs préoccupations éthiques. En 2007, le Dr Shinya Yamanaka et son équipe inversé le processus de programmation de la cellule et développé des cellules souches à partir de cellul....

Protocole

Déclaration éthique: Ce protocole d'étude a été approuvé par le comité d'examen institutionnel de l'Université catholique de Corée (KC12TISI0861).

1. synoviocytes Isolement et expansion

1. synoviocytes Isolation
   1. Stériliser deux paires de ciseaux chirurgicaux et une paire de pinces.
   2. Transférer le tissu synovial à 100 mm plat et on lave avec 5 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 1% de pénicilline / streptomycine.
   3. Coupez les résidus jaunâtres de tissu adipeux et des os. Transférer le tissu coupé à un puits d'une plaque à 6 puits et on ajoute 5 ml de milieu de Eagle modifié par Dulbecco....

Résultats

Dans cette étude, nous décrivons un protocole pour générer CSPi de FLSS en utilisant un système lentiviral. La figure 1A montre un schéma simple du protocole d'isolement FLS. À la suite de l'ablation chirurgicale de la synovie, le tissu a été haché en petits morceaux avec des ciseaux chirurgicaux. Collagénase a été ajouté à isoler les cellules à partir des amas de tissu. Les cellules ont été mises en incubation pendant 14 jours avant le traitement ultérieur. La <.......

Discussion

Avant la découverte de CSPi, les scientifiques ont utilisé principalement les CES pour étudier la biologie des cellules souches et d'autres lignées cellulaires grâce à la différenciation. Cependant, les CES proviennent de la masse interne d'un blastocyste, qui est un embryon à un stade précoce. Pour isoler les CES, la destruction du blastocyste est inévitable, ce qui soulève des questions éthiques qui sont impossibles à surmonter. En outre, bien que les CES ont des caractéristiques stemness et pluripotence, ils .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plat de 100 mm	TPP	93100
Plaque à 6 puits	TPP	92006
50 ml Tube cornical	SPL	50050
15 mlL Tube cornical	SPL	50015
Pipette jetable 10 ml Falcon		7551
5 ml Pipette jetable	Falcon	7543
Plaque à 12 puits	TPP	92012
FLS Matériaux d’isolation
Ciseaux
Pince
DPBS	Life Technologies	14190-144
DMEM	Life Technologies	11995-073
Pénicilline Streptomycine	Sigma Aldrich	P4333
Sérum de veau fœtal (FBS)	Life Technologies	16000-044
Collagénase	Sigma Aldrich	C6885-100MG
Parafilm	Sigma Aldrich	54956
PBS/1 mM EDTA	Life Technologies	12604-039
iPSC Generation Materials
DMEM	Life Technologies	11885
MEM Solution d’acides aminés non essentiels (100x)	Life Technologies	11140-050
&beta ;-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148
Polybrene	Chemicon	TR-1003-G
Pénicilline Streptomycin	Life Technologies	P4333
Sérum fœtal bovin (FBS)	Life Technologies	16000-044
DPBS	Life Technologies	14190-144
Lentivirus
DMEM/F12, HEPES	Life Technologies	11330-057	Ingrédient du milieu iPSC (500 ml)
Bicarbonate de sodium	Life Technologies	25080-094	Ingrédient du milieu iPSC (Conc. : 543 &mu ; g/ml)
Sélénite de sodium	Sigma Aldrich	S5261	Ingrédient du milieu iPSC  ; (Conc. : 14 ng/mL)
Ingrédient du milieu humain Transfferin	Sigma Aldrich	T3705	iPSC (Conc. : 10.7 &mu ; g/ml)
Basic FGF2	Peprotech	100-18B	iPSC media ingredient  ; (Conc. : 100 ng/ml)
Human Insulin	Life Technologies	12585-014	Ingrédient du milieu iPSC (Conc. : 20 &mu ; g/ml)
TGF humain & bêta ; 1	Peprotech	100-21	iPSC (Conc. : 2 ng/ml)
Acide ascorbique	Sigma Aldrich	A8960	Ingrédient du milieu iPSC  ; (Conc. : 64 &mu ; g/ml)
Polybrène	Chemicon	TR-1003
Butyrate de sodium	Sigma Aldrich	B5887
Vitronectin	Life Technologies	A14700
Inhibiteur	de ROCK Sigma Aldrich	Y0503
strong>Guality Control Materials
18 mm Verre de couverture Superior		HSU-0111580
4 % Paraformaldyhyde (PFA)	Tech & Innovation	BPP-9004
Triton X-100	BIOSESANG	9002-93-1
Albumine sérique bovine (BSA)	Vector Lab	SP-5050
Anticorps anti-SSEA4	Millipore	MAB4304
Anticorps anti-oct4	Santa Cruz	SC9081
Anticorps anti-TRA-1-60	Millipore	MAB4360
Anticorps anti-Sox2	Biolegend	630801
Anticorps anti-TRA-1-81	Millipore	MAB4381
Anticorps anti-Klf4	Abcam	ab151733
Alexa Fluor 488 chèvre anti-souris IgG (H+L) Anticorps	Sonde moléculaire	A11029
Alexa Fluor 594 chèvre anti-lapin IgG (H+L)	Sonde moléculaire	A11037
Sonde moléculaire	DAPI	D1306
Réactif anti-décoloration Prolong gold	Invitrogen	P36934
Verre lame, revêtu	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroforme	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore	109634
Ethanol	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand kit de synthèse d’ADNc	Thermo Scientfic	K1622
i-Taq DNA Polymerase	iNtRON BIOTECH	25021
UltraPure 10x TBE Buffer	Life Technologies	15581-044
loading star	Dyne Bio	A750
Agarose	Sigma-Aldrich	9012-36-6
1 kb (+) Marqueur d’échelle d’ADN	Enzynomics	DM003
Phosphatase alcaline	Millipore	SCR004