関節リウマチ患者の関節から分離された線維芽細胞様滑膜細胞を用いて誘導多能性幹細胞の生成
Summary
ここでは、フィーダー細胞なしでレンチウイルス系を用いて、患者由来の線維芽細胞様滑膜細胞から誘導された多能性ヒト幹細胞を生成するためのプロトコルを説明します。
Abstract
成熟した体細胞を再プログラミング因子の定義されたセットを使用して、多能性幹細胞のような状態に反転させることができます。 Oct4、Sox2、Klf4及びc-Myc：多くの研究は、4つの山中転写因子を形質導入することにより、様々な体細胞型から誘導され、多能性幹細胞（性IPSC）を生成しています。性IPSCの研究は、生物学的および臨床研究の最先端に残ります。 iPS細胞は、任意の個々の組織から誘導することができるので、特に、患者特異的iPS細胞は、疾患の病理生物学の研究のための先駆的なツールとして使用することができます。関節リウマチ（RA）は、関節内の軟骨および骨の構造の破壊によって分類慢性炎症性疾患です。滑膜過形成は、RAにおけるこれらの結果につながる主な理由や症状の一つです。線維芽細胞様滑膜細胞（FLSS）は過形成滑膜における主成分細胞です。関節内のFLSSは限りなく、最終的に隣接cartilに侵入、増殖します年齢や骨。現在、過形成性滑膜は、外科的処置によって除去することができます。削除された滑膜は、関節の炎症状態を反映する材料として、RAの研究のために使用されます。 RAの病因における主要なプレーヤーとして、FLSSは、RA患者の性IPSCを生成し、調査するための材料として使用することができます。本研究では、iPS細胞を生成するために、RA患者のFLSSを使用しました。レンチウイルス系を用いて、我々は、FLSSがRA患者固有のIPSCを生成することができることを発見しました。 FLSSから生成されたiPS細胞は、さらに、将来のRAの病態生理学を研究するためのツールとして使用することができます。
Introduction
多能性幹細胞は、様々な臨床的および生物学分野における次世代プラットフォームです。それらは、疾患モデル、薬物スクリーニング、および再生医療の治療に用いることができる有望なツールです。ヒト胚性幹細胞（hESC）は、主に研究し、多能性細胞を理解するために使用しました。しかしながら、ヒト胚盤胞の破壊により単離し、ヒトES細胞は、いくつかの倫理的な問題と関連しています。 2007年には、博士山中伸弥と彼のチームは、セルプログラミングプロセスを逆転し、ヒト成体の体細胞1,2から幹細胞を開発しました。したがって、ヒトES細胞とは異なり、誘導された多能性幹細胞（iPS細胞）は、倫理的なハードルを回避し、成熟した体細胞から生成することができます。
Oct4、Sox2の、Klf4及びc-Myc：通常、性IPSCは、4つの外因性遺伝子の送達によって生成されます。これらの山中因子は、もともとレンチウイルスおよびレトロウイルス系を使用して配信されます。最初のiPS細胞は、マウスの体細胞cから誘導されましたells 3。その後、技術は、ヒト皮膚線維芽細胞1,2に適用しました。その後の研究に成功し、尿4、血液5,6、ケラチノサイト7、およびいくつかの他の細胞型など、さまざまなソースからのiPS細胞を、生成されました。しかし、いくつかの体細胞再プログラミングに使用されていない細胞、および疾患状態の特定の組織からの種々の細胞型の再プログラミング能力のスクリーニングがあり、依然として必要とされています。
関節リウマチ（RA）は、すべての関節を打つと他の臓器における自己免疫疾患につながる可能性疾患です。 RAは、先進国で成人の約1％に影響を与えます。それはむしろ一般的な疾患であり、その発生率は毎年8増加します。しかし、RAは、初期の段階で特定するのは困難であると破壊onceboneダメージを回復することができない治療法がありませんが発生します。また、薬物の有効性は、患者に、患者は異なり、衛生兵を予測することは困難です必要とされるINE。したがって、薬物スクリーニング方法の開発が必要とされ、RAの状況を反映することができる細胞材料が必要とされます。
線維芽細胞様滑膜細胞（FLSS）は、RA 9,10の病因における積極的なセルラー参加しています。 FLSSはまた、滑膜と呼ばれる関節包とキャビティとの間滑膜内膜ライニング、中に存在します。関節の構造を支持し、周囲の軟骨に栄養を提供することにより、FLSSは通常、関節機能と維持に重要な役割を果たしています。しかし、RAのFLSSは、浸潤性の表現型を持っています。 RA FLSSは、最終的に無限増殖10によって周囲の骨を破壊し、癌様の表現型を持っています。このユニークな特性を有する、FLSSはRAの病理生物学を反映することができる有望な材料として用いることができます。しかし、これらの細胞はほとんど生産されず、細胞がin vitroでのいくつかの通路を通って行くように細胞表現型を変更します</eメートル>条件。したがって、患者の状態を表すことができるツールとしてRA FLSSを使用するために複雑になることができます。
理論的には、RA患者由来のiPS細胞（RA-性IPSC）は、薬物スクリーニング、さらなる研究のための理想的なツールになることができます。生成されたiPS細胞は、自己再生能を有し、 インビトロで維持し、拡張することができます。多能性と、これらの細胞は、RAおよび他の骨関連疾患11の特定の研究のための細胞物質の寄与することができる成熟した軟骨細胞及び骨細胞系統へ分化させることができます。
本研究では、外科的に除去滑膜からFLSSを分離し、展開する方法を示し、そしてどのように山中因子を含むレンチウイルスを用いて、FLSSからRA-iPS細胞を生成します。
Protocol
Representative Results
Discussion
iPS細胞の発見前に、科学者たちは、主に分化を通じて幹細胞生物学および他の細胞系譜を研究するためのESCを使用していました。しかし、ESCは、初期段階の胚である胚盤胞の内部塊に由来します。 ESCを単離するために、胚盤胞の破壊を克服することは不可能である倫理的な問題を上げ、避けられません。 ESCは、幹細胞性特性および多分化能を有するがまた、それらは個体から得ることがで?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Research Program funded by the Korea Centers for Disease Control and Prevention (HI13D2188).
Materials
| 100mm Dish | TPP | 93100 | |
| 6-well Plate | TPP | 92006 | |
| 50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| 12-well Plate | TPP | 92012 | |
| FLS Isolation Materials | |||
| Surgical Scissors | |||
| Surgical Forcep | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-073 | |
| Penicilin Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | |
| Collagenase | Sigma Aldrich | C6885-100MG | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | 54956 | |
| PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| iPSC Generation Materials | |||
| DMEM | Life Technologies | 11885 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003-G | |
| Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Lentivirus | |||
| DMEM/F12, HEPES | Life Technologies | 11330-057 | iPSC media ingredient (500 mL) |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080-094 | iPSC media ingredient (Conc.: 543 μg/mL) |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | iPSC media ingredient (Conc.: 14 ng/mL) |
| Human Transfferin | Sigma Aldrich | T3705 | iPSC media ingredient (Conc.: 10.7 μg/mL) |
| Basic FGF2 | Peprotech | 100-18B | iPSC media ingredient (Conc.: 100 ng/mL) |
| Human Insulin | Life Technologies | 12585-014 | iPSC media ingredient (Conc.: 20 μg/mL) |
| Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | iPSC media ingredient (Conc.: 2 ng/mL) |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A8960 | iPSC media ingredient (Conc.: 64 μg/mL) |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| Vitronectin | Life Technologies | A14700 | |
| ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Guality Control Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| Anti-Oct4 Antibody | Santa Cruz | SC9081 | |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4360 | |
| Anti-Sox2 Antibody | Biolegend | 630801 | |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Millipore | MAB4381 | |
| Anti-Klf4 Antibody | Abcam | ab151733 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11037 | |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10X TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Alkaline Phosphatase | Millipore | SCR004 |
References
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