Här beskriver vi ett protokoll för att generera humana inducerade-pluripotenta stamceller från patientgenererade fibroblastliknande synoviocyter, med användning av en lentiviral system utan matarceller.
Mogna somatiska celler kan vändas till en pluripotenta stamceller liknande tillstånd med hjälp av en definierad uppsättning av omprogrammering faktorer. Ett flertal studier har genererat inducerad pluripotenta stamceller (iPSCs) från olika somatiska celltyper genom transduktion fyra Yamanaka transkriptionsfaktorer: Oct4, Sox2, Klf4 och c-Myc. Studien av iPSCs kvar på framkanten av biologisk och klinisk forskning. I synnerhet, kan patientspecifika iPSCs användas som ett banbrytande verktyg för studier av sjukdoms Patobiologi, eftersom iPSCs kan induceras från vävnaden för varje individ. Reumatoid artrit (RA) är en kronisk inflammatorisk sjukdom, uppdelade efter förstörelsen av brosk och ben struktur i leden. Synovial hyperplasi är en av de viktigaste orsakerna eller symptom som leder till dessa resultat i RA. Fibroblastliknande synoviocyter (FLSs) är den viktigaste komponenten celler i hyperplastisk synovium. FLSs i fogen obegränsat prolifererar, så småningom invaderar intilliggande cartilålder och ben. För närvarande kan hyper synovium avlägsnas endast genom ett kirurgiskt ingrepp. Den borttagna synovium används för RA forskning som ett material som reflekterar det inflammatoriska tillståndet i leden. Som en stor aktör i patogenesen av RA kan FLSs användas som ett material för att generera och undersöka iPSCs av RA-patienter. I denna studie har vi använt FLSs av en RA-patient att generera iPSCs. Med användning av en lentiviral systemet, upptäckte vi att FLSs kan generera RA patientspecifik iPSC. De iPSCs genereras från FLSs kan vidare användas som ett verktyg för att studera patofysiologin för RA i framtiden.
Pluripotenta stamceller är nästa generations plattform i olika kliniska och biologiska områdena. De är ett lovande verktyg som kan användas i sjukdomsmodellering, drug screening, och regenerativ medicinsk behandling. Mänskliga embryonala stamceller (hESCs) användes främst för att studera och förstå pluripotenta celler. Men isoleras genom förstörelsen av den mänskliga blastocysten är hESCs i samband med flera etiska betänkligheter. År 2007, Dr Shinya Yamanaka och hans team omvänd cell programmeringsprocessen och utvecklat stamceller från mänskliga vuxna somatiska celler 1,2. Därför, till skillnad från hESCs, inducerade-pluripotenta stamceller (iPSCs) kan genereras från mogna somatiska celler, som man undviker de etiska hinder.
Vanligtvis är iPSCs genereras av leverans av fyra exogena gener: Oct4, Sox2, Klf4, och c-Myc. Dessa Yamanaka faktorer ursprungligen levereras med hjälp av lentivirala och retrovirala system. De första iPSCs härleddes från mus somatisk calnar 3. Efteråt var den teknik som tillämpas på humana dermala fibroblaster 1,2. Senare studier framgångsrikt genererade iPSCs från olika källor, såsom urin 4, blod 5,6, keratinocyter 7, och flera andra celltyper. Det finns dock några somatiska celler som inte har använts i omprogrammering och screening av omprogrammering kapacitet olika celltyper från specifika vävnader i sjukdomstillstånd, krävs fortfarande.
Reumatoid artrit (RA) är en sjukdom som kan drabba alla skarvar och leda till autoimmuna tillstånd i andra organ. RA drabbar omkring 1% av de vuxna i den utvecklade världen. Det är en ganska vanlig sjukdom och dess förekomst ökar varje år 8. Emellertid är RA svåra att identifiera i de tidiga stadierna och oncebone förstörelse inträffar finns det ingen behandling som kan återställa skadan. Dessutom skiljer sig läkemedlets effektivitet från patient till patient, och det är svårt att förutsäga sjukvårdareine som krävs. Därför behövs utveckling av ett läkemedelsscreeningsmetod, och ett cellmaterial som kan reflektera villkoren i RA krävs.
Fibroblastliknande synoviocyter (FLSs) är en aktiv cellulär deltagare i patogenesen av RA 9,10. FLSs finns i synovial intima foder mellan ledkapseln och hålrum, som också kallas synovium. Genom att stödja den gemensamma strukturen och ge näring till omgivande brosk, FLSs brukar spela en avgörande roll i ledfunktion och underhåll. Emellertid FLSs i RA har en invasiv fenotyp. RA FLSs har en cancer-liknande fenotyp, så småningom förstöra det omgivande benet av oändlig spridning 10. Med denna unika egenskap kan FLSs användas som ett lovande material som kan återspegla patobiologi av RA. Ändå är dessa celler sällan produceras och cellfenotyper ändra när cellerna går igenom flera passager i in vitro </em> villkor. Därför kan det vara komplicerat att använda RA FLSs som ett verktyg som kan representera patientens tillstånd.
Teoretiskt kan RA patientgenererade iPSCs (RA-iPSCs) bli ett idealiskt verktyg för läkemedelsscreening och ytterligare forskning. Genererade iPSCs har självförnyelse förmåga och kan bibehållas och expanderas in vitro. Med pluripotens, kan dessa celler differentieras till mogna kondrocytceller och osteocyte linjer, som kan bidra cellmaterial för specifik forskning i RA och andra benrelaterade sjukdomar 11.
I denna studie visar vi hur man isolera och expandera FLSs från en bortopererad synovium, och hur man skapar RA-iPSCs från FLSs använder lentivirus innehåller Yamanaka faktorer.
Innan upptäckten av iPSCs, forskare används främst ekonomiska och sociala råd att studera stamcellsbiologi och andra cellinjer genom differentiering. Emellertid ESCs härstammar från den inre massan av en blastocyst, vilken är en tidig embryo. För att isolera ekonomiska och sociala råd, är förstörelsen av blastocysten oundviklig, höja etiska frågor som är omöjliga att övervinna. Även om ekonomiska och sociala råden har stemness egenskaper och pluripotens, de kan inte komma från personer och är ibland…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Research Program funded by the Korea Centers for Disease Control and Prevention (HI13D2188).
100mm Dish | TPP | 93100 | |
6-well Plate | TPP | 92006 | |
50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
12-well Plate | TPP | 92012 | |
FLS Isolation Materials | |||
Surgical Scissors | |||
Surgical Forcep | |||
DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
DMEM | Life Technologies | 11995-073 | |
Penicilin Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | |
Collagenase | Sigma Aldrich | C6885-100MG | |
Parafilm | Sigma Aldrich | 54956 | |
PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
iPSC Generation Materials | |||
DMEM | Life Technologies | 11885 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Life Technologies | 11140-050 | |
β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
Polybrene | Chemicon | TR-1003-G | |
Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | |
DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
Lentivirus | |||
DMEM/F12, HEPES | Life Technologies | 11330-057 | iPSC media ingredient (500 mL) |
Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080-094 | iPSC media ingredient (Conc.: 543 μg/mL) |
Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | iPSC media ingredient (Conc.: 14 ng/mL) |
Human Transfferin | Sigma Aldrich | T3705 | iPSC media ingredient (Conc.: 10.7 μg/mL) |
Basic FGF2 | Peprotech | 100-18B | iPSC media ingredient (Conc.: 100 ng/mL) |
Human Insulin | Life Technologies | 12585-014 | iPSC media ingredient (Conc.: 20 μg/mL) |
Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | iPSC media ingredient (Conc.: 2 ng/mL) |
Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A8960 | iPSC media ingredient (Conc.: 64 μg/mL) |
Polybrene | Chemicon | TR-1003 | |
Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
Vitronectin | Life Technologies | A14700 | |
ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
Guality Control Materials | |||
18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
Anti-SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
Anti-Oct4 Antibody | Santa Cruz | SC9081 | |
Anti-TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4360 | |
Anti-Sox2 Antibody | Biolegend | 630801 | |
Anti-TRA-1-81 Antibody | Millipore | MAB4381 | |
Anti-Klf4 Antibody | Abcam | ab151733 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11029 | |
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11037 | |
DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
UltraPure 10X TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
loading star | Dyne Bio | A750 | |
Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
1kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
Alkaline Phosphatase | Millipore | SCR004 |