सामरिक Endothelial सेल ट्यूब गठन परख: मुकाबले बाह्य मैट्रिक्स और विकास फैक्टर कम बाह्य मैट्रिक्स

Summary

This manuscript describes a tube formation assay to quantify the effects of a given compound or condition on angiogenesis by using endothelial cell tube formation in a controlled environment.

Abstract

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient’s blood stream by hijacking the process of angiogenesis, in which new blood vessels are formed from existing blood vessels. The CXCR2 (chemokine (C-X-C motif) receptor 2) receptor is a transmembrane G-protein-linked molecule found in many cells that is closely associated with angiogenesis¹. Specific blockade of the CXCR2 receptor inhibits angiogenesis, as measured by several assays such as the endothelial tube formation assay. The tube formation assay is useful for studying angiogenesis because it is an excellent method of studying the effects that any given compound or environmental condition may have on angiogenesis. It is a simple and quick in vitro assay that generates quantifiable data and requires relatively few components. Unlike in vivo assays, it does not require animals and can be carried out in less than two days. This protocol describes a variation of the extracellular matrix supporting endothelial tube formation assay, which tests the CXCR2 receptor.

Introduction

क्रम में पोषक तत्वों के अस्तित्व के लिए आवश्यक प्राप्त करने के लिए, घातक ट्यूमर रोगी के रक्त प्रवाह के लिए उपयोग की आवश्यकता है। उस तक पहुँच पाने के लिए, ट्यूमर कोशिकाओं, रासायनिक संकेतों कि ट्यूमर को नई रक्त वाहिकाओं के विकास को प्रोत्साहित रिलीज इस प्रकार angiogenesis ² के रूप में जाना सामान्य शारीरिक प्रक्रिया अपहरण। यह angiogenesis कि मेटास्टेसिस (यानी, अन्य अंगों में कैंसर के प्रसार) हो सकता है के माध्यम से बनाया रक्त वाहिकाओं के माध्यम से भी है। क्योंकि angiogenesis की प्रक्रिया इतनी तरह के कैंसर का इतना व्यापक विविधता की प्रगति के लिए महत्वपूर्ण है, यह कैंसर विरोधी चिकित्सा अनुसंधान ³ में एक आकर्षक लक्ष्य है।

एक angiogenesis यों इस्तेमाल तरीका है जब एक बाह्य मैट्रिक्स पर रखा endothelial पूर्वज सेल की नलियों फार्म की क्षमता को मापने के लिए है। क्योंकि इन ट्यूबों के गठन angiogenesis में एक महत्वपूर्ण प्रारंभिक कदम है, पर्यावरण की स्थिति (जैसे, उपस्थिति या किसी दिए गए सीओ की कमी का परीक्षणmpound) कि उत्तेजित या बाधित कर सकते हैं ट्यूब गठन विशिष्ट कदम है कि angiogenesis को बाधित करने का लक्ष्य रखा जा सकता है में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। Endothelial सेल ट्यूब गठन परख सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया ⁴ इन विट्रो तरीकों कि 'कोशिकाओं नलियों फार्म की क्षमता उपायों में से एक है। यह एक सरल परख, अपेक्षाकृत कुछ घटकों और एक छोटी संस्कृति अवधि ⁵ की आवश्यकता होती है। शायद सबसे महत्वपूर्ण बात है, तथापि, कि डेटा परख के इस प्रकार से प्राप्त quantifiable है।

ट्यूब गठन परख के उपयोग के लिए एक उदाहरण संवहनी endothelial बाह्य मैट्रिक्स बनाम वृद्धि कारक कम हो (जीएफआर) बाह्य मैट्रिक्स पर विकसित कोशिकाओं से ट्यूबों के विकास की तुलना करना शामिल है। बाह्य मैट्रिक्स एक तहखाने झिल्ली की तरह सार्कोमा कोशिकाओं और उसके मुख्य घटक से अलग सामग्री है laminin, प्रकार चतुर्थ कोलेजन, वृद्धि कारक है और प्रोटेयोग्लाईकैन्स हैं। कुछ यौगिकों जब में ट्यूबों के लिए फार्म सेल की क्षमता पर अलग प्रभाव हैकम वृद्धि कारकों और कम Heparan सल्फेट प्रोटेयोग्लाईकैन्स (HSPGs) के साथ एक वातावरण। HSPGs बाह्य मैट्रिक्स का एक घटक है जो काफी जीएफआर बाह्य मैट्रिक्स में कम है। एक उदाहरण के रूप में, यदि परिकल्पना ऐसे SB225002, जो ब्लॉक CXCR2 रिसेप्टर, काफी कमजोर ट्यूब गठन जब HSPGs प्रचुर मात्रा में हैं बाधित करने के लिए क्षमता है के रूप में angiogenesis अवरोधकों, तो बाह्य मैट्रिक्स और जीएफआर बाह्य मैट्रिक्स में ट्यूब गठन गतिविधि के बीच एक तुलना है HSPGs के नियंत्रण के माध्यम से angiogenesis निषेध की संभावना तलाश में महत्वपूर्ण है।

अन्य assays कि आमतौर पर angiogenesis यौगिकों के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए उपयोग किया जाता है विवो तरीकों में हैं। इस बात का उल्लेखनीय उदाहरण लड़की chorioallantoic झिल्ली (सीएएम) परख ⁶ चिकन अंडे का उपयोग कर रहे हैं, और इन विवो Matrigel चूहों का उपयोग angiogenesis परख ⁷ प्लग। इन विवो प्रक्रिया टी में angiogenesis को मापने जबकिhree आयाम और इन विट्रो ट्यूब गठन परख की तुलना में मानव शरीर के अधिक प्रतिनिधि हैं, वे काफी अधिक समय की आवश्यकता के दोष पीड़ित हैं और काफी अधिक प्रदर्शन करने के लिए मुश्किल हो जाता है। दोनों सीएएम परख और बाह्य प्लग परख कम से कम एक सप्ताह ⁸ लेते हैं, क्या करना है, जबकि इसकी तुलना में, ट्यूब गठन परख एक ही दिन में किया जा सकता है और यह जानवर के उपयोग की आवश्यकता नहीं है।

यह ध्यान रखें कि endothelial इस रिपोर्ट में इस्तेमाल किया कोशिकाओं मानव नाल नस endothelial कोशिकाओं (HUVEC) कर रहे हैं महत्वपूर्ण है। इन कोशिकाओं को संवहनी अंकुर और रक्त वाहिकाओं के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, और पर्याप्त कैंसर में endothelial कोशिकाओं के अनुरूप दोनों इन विट्रो और इन विवो प्रयोगों ⁹ में विरोधी angiogenesis गतिविधियों का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल हो रहे हैं। इस तरह के प्राथमिक microvascular endothelial कोशिकाओं के रूप में अन्य कोशिकाओं को भी इस्तेमाल किया जा सकता है।

यह भी ध्यान दें कि कम होने के अलावा महत्वपूर्ण हैHSPGs का स्तर, जीएफआर बाह्य मैट्रिक्स भी कई घटकों का स्तर कम हो गया है जब सामान्य बाह्य मैट्रिक्स की तुलना में। यह भी शामिल है, लेकिन सीमित नहीं है: EGF, IGF-1, PDGF, और TGF-बीटा। उन प्रयोगों प्रदर्शन angiogenesis के संबंध में इन यौगिकों के महत्व का अध्ययन जीएफआर बाह्य मैट्रिक्स का उपयोग करने में रुचि हो सकती है।

Protocol

1. सेल संस्कृति बीज 3×10 एक 75 सेमी फ्लास्क में पूरा मध्यम विकास 10 से 10 मिलीलीटर में 5 HUVEC कोशिकाओं। कोशिकाओं 70-80% संगम सीओ 2 5% में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। 2. छोटी नली गठन परख 4 डिग्री सेल्सियस पर बर्फ पर रात भर या तो वृद्धि कारक कम (जीएफआर) बाह्य मैट्रिक्स या सामान्य बाह्य मैट्रिक्स गला लें। नोट: संक्षिप्तता की 'बाह्य मैट्रिक्स के कारण आगे से दोनों जीएफआर और सामान्य बाह्य मैट्रिक्स संदर्भ के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। उन्हें तैयार करने की प्रक्रिया के समान है। बर्फ पर 96 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों रखें, और अच्छी तरह से पूर्व ठंडा युक्तियों का उपयोग प्रति ठंडा बाह्य मैट्रिक्स के 50 μl जोड़ें। 5 केवल सामान्य बाह्य मैट्रिक्स युक्त कुओं की तीन प्रतियों तैयार करें। 5 केवल जीएफआर बाह्य मैट्रिक्स युक्त कुओं का एक और तीन प्रतियों तैयार करें। 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 96 अच्छी तरह से थाली सेते हैं। धो HUVECsकैल्शियम और मैग्नीशियम (पीबीएस) के बिना फॉस्फेट बफर समाधान है, और के साथ एक बार 1 मिलीलीटर 0.05% trypsin EDTA जोड़ें। 1-5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पकवान सेते हैं, कोशिकाओं हर मिनट की जाँच जब तक सबसे कोशिकाओं दौर। एक बार कुप्पी दोहन से कोशिकाओं को बेदखल। 5 मिलीलीटर बेसल मध्यम जोड़ें 1% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ (कुछ भी बिना यानी, endothelial सेल मध्यम विकास (जैसे, पूरक) जोड़ा)। pipetting द्वारा फ्लास्क में कोशिकाओं को इकट्ठा और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब को हस्तांतरण। 5 मिनट के लिए 200 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। 2 मिलीलीटर बेसल माध्यम के साथ पुनः निलंबित एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गिनती, और 2-3 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल सेल एकाग्रता समायोजित करें। बेसल मध्यम में CXCR2 अवरोध SB225002 के निम्नलिखित 10x सांद्रता के 100 μl तैयार: 11 माइक्रोन के, 5.6 सुक्ष्ममापी, 1.1 सुक्ष्ममापी, 0.56 सुक्ष्ममापी और 0 माइक्रोन के (नियंत्रण)। प्रत्येक 5 माइकर में HUVEC निलंबन के 300 μl पिपेटocentrifuge ट्यूबों। अवरोध सांद्रता के 33 μl जोड़ें (11 माइक्रोन के, 5.6 सुक्ष्ममापी, 1.1 सुक्ष्ममापी, 0.56 सुक्ष्ममापी और 0 माइक्रोन) के एक ट्यूब में प्रत्येक HUVECs, और भंवर से युक्त। पिपेट बाह्य मैट्रिक्स के व्यक्तिगत कुओं के लिए सेल निलंबन (1-1.5 x 10 4 कोशिकाओं) में से प्रत्येक के 50 μl। तीन प्रतियों में प्रत्येक निलंबन की थाली और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर 4-16 घंटे के लिए सेते हैं। 4-16 घंटे के बाद, ट्यूब में अच्छी तरह से एक औंधा माइक्रोस्कोप कैमरा 11 (मूल बढ़ाई x 100) का उपयोग प्रति गठन के 4 तस्वीरें ले लो। 3. छोटी नली विघटन परख ट्यूब गठन परख के रूप में (कदम 2.3 के लिए 2.1) एक ही विनिर्देशों के अनुसार बाह्य मैट्रिक्स और प्लेटें तैयार करें। अच्छी तरह से प्रति 50 μl में एक 96 अच्छी तरह से थाली बाह्य मैट्रिक्स युक्त चरणों में वर्णित के रूप में 2.4- ट्यूब गठन परख और विभाज्य की 2.4.2 HUVEC निलंबन तैयार करें। नोट: थाली पर्याप्त कुओं रोंहे कि नशीली दवाओं के उपचार प्रति 3 कुओं देखते हैं। 37 डिग्री सेल्सियस से कम 4 घंटे के लिए बाह्य मैट्रिक्स पर कोशिकाओं को विकसित, 5% सीओ 2। नशीली दवाओं के उपचार की दीक्षा से पहले छवियों ले लो। ट्यूब गठन परख के कदम 2.5 में वर्णित के रूप में CXCR2 अवरोध SB225002 की 2x सांद्रता तैयार है, और 96 अच्छी तरह से थाली HUVECs युक्त के प्रति अच्छी तरह से प्रत्येक एकाग्रता के 50 μl जोड़ें। तीन प्रतियों में प्रत्येक एकाग्रता प्लेट। 37 डिग्री सेल्सियस पर एक और 2-12 घंटे के लिए थाली सेते हैं, 5% सीओ 2। नलियों प्रत्येक में गठित अच्छी तरह से एक औंधा माइक्रोस्कोप कैमरे का उपयोग (मूल बढ़ाई × 100) 11 के 4 छवियों ले लो। 4. बढ़ाता डेटा चार यादृच्छिक सूक्ष्म खेतों में ट्यूब की कुल ट्यूब लंबाई मापने माइक्रोस्कोप कैमरा सॉफ्टवेयर का उपयोग करके ट्यूब गठन छवियों में कब्जा मूल्यांकन। माइक्रोस्कोप कैमरा सॉफ्टवेयर में छवि को खोलने, और 'एनोटेशन और माप क्लिक करें9 ;. 'लंबाई' अनुभाग के अंतर्गत, 'सरल रेखा' उपकरण का चयन करें। छवि पर क्लिक करें, फिर ट्यूब की लंबाई के साथ एक रेखा खींचना है, तो ठीक क्लिक करें। नोट: सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से पिक्सल में लाइन की लंबाई की गणना और एक फ़ाइल में डेटा को रखा जाएगा। 'सरल' लाइन उपकरण का चयन करके छवि में सभी ट्यूब लाइनों के लिए प्रक्रिया को दोहराएं। छवि पर क्लिक करें, फिर ट्यूब की लंबाई के साथ एक रेखा खींचना है, तो ठीक क्लिक करें। नोट: सॉफ्टवेयर प्रत्येक लाइन की लंबाई रिकॉर्ड और स्क्रीन पर डेटा को प्रदर्शित करेगा। तस्वीर में हर ट्यूब को मापने के बाद, 'निर्यात' पर क्लिक करें तो चुना 'स्प्रेडशीट के लिए लंबाई'। नोट: लंबाई डेटा एक स्प्रेडशीट के लिए निर्यात किया जाएगा। कुल ट्यूब लंबाई पाने के लिए स्प्रेडशीट से ट्यूब लंबाई के सभी जोड़े। गणना और ट्यूब की औसत लंबाई रिकॉर्ड है। नोट: चार प्रतिकृति मतलब है और मानक विचलन चुना गया साथ की सिफारिश कर रहे हैं। 5. बाह्य मैट्रिक्स संस्कृति से उबरने प्रकोष्ठों संस्कृति और एक ट्यूब गठन परख प्रदर्शन एक 96 अच्छी तरह से थाली पर्याप्त कोशिका गिनती उपज नहीं होगा के रूप में एक बड़े पैमाने पर (धारा 2 देखें)। 12 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए, बाह्य मैट्रिक्स के 500 μl और HUVEC सेल निलंबन के 500 μl (1.5×10 5 कोशिकाओं) का उपयोग करें। आदेश ट्यूबों के लिए फार्म में 4-16 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं। फिर, सेल संस्कृति के माध्यम aspirate। कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना ठंड 1x पीबीएस के 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं कुल्ला। संस्कृति पर बर्फ के ठंडे पीबीएस 2.5 मिमी EDTA बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ें और 10 मिनट के लिए बर्फ पर रहते हैं। एक 1000 μl विंदुक टिप का उपयोग टिप के साथ काट पकवान से कोशिकाओं और बाह्य मैट्रिक्स मिश्रण जगह देना, और फिर एक ठंड 15 मिलीलीटर ट्यूब को हस्तांतरण, धोने में अच्छी तरह से साथ 4 बर्फ की मिलीलीटर ठंड पीबीएस 2.5 मिमी EDTA और ट्यूब में डाल दिया । 1-4 घंटे के लिए बर्फ पर ट्यूबों रखो और बाह्य के सभी जब तक ट्यूब एक बार कुछ पलटनामैट्रिक्स भंग कर रहा है। 0 डिग्री सेल्सियस पर 1620 XG पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र बर्फ पर एक 1.ml ट्यूब के लिए 1 मिलीलीटर ठंड पीबीएस के साथ सेल छर्रों फिर से निलंबित। फिर से 0 डिग्री सेल्सियस पर 3,000 XG पर 5 मिनट के लिए, फिर सतह पर तैरनेवाला के निपटान के सेंट्रीफ्यूज। -80 डिग्री सेल्सियस में सेल की दुकान।

Representative Results

काफी है, स्वस्थ endothelial ट्यूब गठन आसानी से माइक्रोस्कोपी छवियों में हिचकते ट्यूब गठन के विपरीत किया जा सकता है। स्वस्थ ट्यूब गठन केशिका संरचनाओं की तरह (चित्रा 1) का एक संगठित वेब के रूप में प्रकट होता है। इसकी तुलना में हिचकते ट्यूब गठन बिखरे हुए कोशिकाओं (चित्रा 2) के रूप में प्रकट होता है। ट्यूब गठन परख डेटा केशिका ट्यूब (तालिका 1) के कुल ट्यूब लंबाई मापने के द्वारा मात्रा निर्धारित है। कुल ट्यूब लंबाई इसके अलावा, औसत ट्यूब लंबाई, ट्यूब की कुल संख्या, या शाखा अंक की कुल संख्या मापा जा सकता है। स्ट्रक्चर्ड ट्यूब गठन बिखरे हुए हिचकते ट्यूब वृद्धि की तुलना में अधिक से अधिक शुद्ध ट्यूब लंबाई पैदावार। चित्रा 3 में, एक खुराक प्रतिक्रिया वक्र जीएफआर बाह्य मैट्रिक्स और एक CXCR2 अवरोध SB225002 पर HUVECs की प्रयोगात्मक शर्तों के तहत 50 आईसी की गणना के लिए परमिट। <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1"> चित्रा 1. Endothelial बाह्य मैट्रिक्स और विकास के कारक कम (जीएफआर) बाह्य मैट्रिक्स पर टी उबे गठन। दो छवियों बाह्य मैट्रिक्स (ए) और जीएफआर बाह्य मैट्रिक्स (बी) पर सफल ट्यूब गठन दिखा। ट्यूबों के परस्पर नेटवर्क साफ पता चलता है इन HUVECs में स्वस्थ है कि ट्यूब की वृद्धि हुई है। स्केल बार = 10 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा 2 पर बाह्य और विकास के कारक कम (जीएफआर) एक CXCR2 अवरोध SB225002 (5.6 माइक्रोन) के द्वारा बाह्य मैट्रिक्स। ट्यूब गठन के निषेध दो छवियों ट्यूब दिखानेगठन कि बाह्य मैट्रिक्स (ए) और जीएफआर बाह्य मैट्रिक्स (बी) पर एक CXCR2 अवरोध SB225002 (5.6 माइक्रोन) के द्वारा हिचकते किया गया है। HUVEC कोशिकाओं इस छवि शो में देखा के अलग गुच्छों कि कोशिकाओं को एक दूसरे से कनेक्ट करने के लिए आवश्यक ट्यूबों के रूप में सक्षम नहीं थे। स्केल बार = 10 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। विकास का पहलू को कम (जीएफआर) बाह्य मैट्रिक्स पर चित्रा 3. खुराक प्रतिक्रिया वक्र। एक्स अक्ष ट्यूब लंबाई पता चलता है और शाफ़्ट एक CXCR2 अवरोध की एकाग्रता से पता चलता है। खुराक प्रतिक्रिया वक्र से पता चलता है कि जीएफआर बाह्य मैट्रिक्स पर CXCR2 अवरोध को HUVEC प्रतिक्रिया खुराक निर्भर है। आईसी 50 (आधा अधिक से अधिक अवरोधY एकाग्रता) सॉफ्टवेयर का उपयोग कर 13 और बाह्य मैट्रिक्स के लिए एक खुराक प्रतिक्रिया की अवस्था के साथ तुलना की जा सकती है, उदाहरण के लिए द्वारा गणना की गई। आईसी 50 अवरोध है कि 50% तक कम हो जाती है प्रतिक्रिया की एकाग्रता है। त्रुटि सलाखों के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते। विकास फैक्टर कम (जीएफआर) बाह्य मैट्रिक्स और अवरोध (4 प्रत्येक प्रतिकृति) कुल ट्यूब लंबाई औसत (पिक्सल) (1 पिक्सेल = 0.34 माइक्रोन) मानक विचलन पी मूल्य जीएफआर बाह्य मैट्रिक्स नियंत्रण 2447 168.174 जीएफआर बाह्य मैट्रिक्स + 0.56 सुक्ष्ममापी SB225002 1422.5 185.4218 0.000395 जीएफआर बाह्य मैट्रिक्स + 1.1 माइक्रोन के SB225002 1004 126.1784 2.14 x 10 -5 जीएफआर बाह्य मैट्रिक्स + 5.6 माइक्रोन के SB225002 519.25 129.6368 4.19 x 10 -6 जीएफआर बाह्य मैट्रिक्स + 11 माइक्रोन के SB225002 393.75 212.6857 1.21 x 10 -5 तालिका 1 बदलती परिस्थितियों में वृद्धि कारक कम हो (जीएफआर) बाह्य मैट्रिक्स पर कुल ट्यूब लंबाई बढ़ाता। कुल ट्यूब लंबाई CXCR2 अवरोध की सांद्रता के साथ अलग जीएफआर बाह्य मैट्रिक्स पर हो नमूनों में दर्ज की गई है का उपयोग कर एक मेज के एक भाग। आंकड़ों से संकेत मिलता है कि CXCR2 अवरोध ट्यूब गठन को बाधित करता है। इस तरह चार प्रतिकृति, मानक विचलन का औसत है, और पी मूल्य के रूप में जुड़े मूल्यों शामिल हैं। पिक्सल दिखाने के लिए में मापा जाता हैडेटा है कि निर्यात कर रहे हैं। आईसी 50 सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर 13 का उपयोग करके गणना की जा सकती है। (1 पिक्सेल = 0.34 माइक्रोन)

Discussion

जब इस परख का आयोजन, यह सब समय पर बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर बाह्य मैट्रिक्स रखने के लिए जब तक अन्यथा निर्दिष्ट आवश्यक है। बाह्य मैट्रिक्स ऊपर 4 डिग्री सेल्सियस गर्म करने के लिए अनुमति दी है, तो यह भाजन जाएगा, और परख बर्बाद हो जाएगी। यह भी है कि कुछ भी है कि संपर्क में आता है सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है (जैसे, pipet सुझावों, प्लेट) बाह्य मैट्रिक्स के साथ पूर्व ठंडा ऊपर उल्लिखित कारण के लिए है। प्रत्येक कुएं में वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की संख्या महत्वपूर्ण है, बहुत कुछ कोशिकाओं, नियंत्रण नमूना में उम्मीद की वेब नहीं देना होगा भी कई कोशिकाओं बड़े सेल समूहों या एक monolayer बनेगी और परख मान्य नहीं होगा। इस परख की सफलता में एक अन्य महत्वपूर्ण कारक HUVECs की सेल बीतने संख्या है। बीतने संख्या हमेशा दस से कम होना चाहिए, अन्यथा मजबूत ट्यूब गठन नहीं हो सकता है। इसके अलावा, एक यह सुनिश्चित करना चाहिए कि सेल संस्कृति के माध्यम से इस्तेमाल किया जा रहा समाप्त हो गया है, या कोशिकाओं व्यवहार्य नहीं होगा। alternatively, एक माध्यम है और इसके घटकों विभाज्य और समाप्ति तिथि के बाद समय की अवधि के लिए संरक्षित करने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें स्टोर कर सकते हैं। बेशक, यह अभी भी समाप्ति की तारीख से पहले माध्यम का उपयोग करने के लिए बेहतर है

सभी प्रक्रियाओं की तरह, वहाँ endothelial सेल ट्यूब गठन परख का आयोजन करने के लिए कुछ नुकसान कर रहे हैं। एक प्रमुख समस्या यह है कि, क्योंकि वहाँ endothelial कोशिकाओं और समर्थन matrices के विभिन्न प्रकार के होते हैं, परख के परिणामों पर जो सेल और मैट्रिक्स के प्रकार के आधार पर किया जाता है, बहुत भिन्न हो सकते है। endothelial इस्तेमाल कोशिकाओं (HUVECs, HAECs या HMVECs) प्राथमिक कोशिकाओं, वे अमर कोशिकाओं की तुलना में पाने के लिए और परिवर्तनशीलता के लिए करना महंगा हो रहे हैं। प्राथमिक कोशिकाओं के उपयोग के लिए सीमित मार्ग है, और इसलिए लंबी अवधि के angiogenesis प्रयोगों ^{14 के} लिए उपयुक्त नहीं हैं। विश्वसनीय डेटा के लिए, एक हमेशा परख के लिए एक ही प्रकार का उपयोग करना चाहिए। इन विट्रो assays में दूसरे के साथ के रूप में, एक ट्यूब गठन परख के परिणामों को चुनाव होना चाहिए, विवो में मजबूती आई है क्योंकि दो आयामी टिशू कल्चर के नियंत्रण में है और कृत्रिम स्थितियों से परिणाम हमेशा एक जीवित जीव की जटिल Biosystem में परिलक्षित नहीं किया जा सकता है। यह भी महत्वपूर्ण है कि परख के इस प्रकार के केवल endothelial सेल ट्यूब गठन प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता ध्यान में रखना ट्यूब बनाने कोशिकाओं है, और दूसरे, गैर endothelial परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए।

इस परख एक यौगिक के एन्जियोजेनिक संभावित यों तो एक नहीं बल्कि सरल और त्वरित तरीका है। यह भी आगे के प्रयोगों के लिए एक मंच का निर्माण करती है, अकेले रूप में, यह है जिसके द्वारा यौगिक वास्तव में पोत बनाने की प्रक्रिया को प्रभावित करता है विशिष्ट तंत्र के बारे में जानकारी उपज नहीं है। हालांकि, विभिन्न बाह्य matrices के उपयोग कैसे आगे जो आमतौर पर इस्तेमाल नहीं किया है अनुसंधान के सवालों के लिए एक रूपरेखा बनाने के लिए एक उदाहरण है। वहाँ विशिष्ट अवरोधकों कि के घटकों को निशाना सहित परिसर के विशिष्ट जैव रासायनिक तंत्र का अध्ययन करने के लिए दृष्टिकोण हैंangiogenesis मार्ग। एक और दृष्टिकोण endothelial कोशिकाओं से शाही सेना को निकालने और आरटी पीसीआर (रियल टाइम पीसीआर) ¹² उपयोग जीन अभिव्यक्ति की परिवर्तन जो परख में मनाया विकास व्यवहार का कारण बन सकता का विश्लेषण करने के लिए हो सकता है। इस विधि का भविष्य अनुप्रयोगों angiogenesis मार्ग की विशेष कदम के लिए तोड़े नीचे assays बनाने के लिए HUVECs ट्रांसफ़ेक्ट शामिल हैं। वहाँ lymphangiogenesis मार्ग का अध्ययन करने के लिए इस दृष्टिकोण को लागू करने की क्षमता है। बाह्य मैट्रिक्स घटकों में फेरबदल करके, मैट्रिक्स और सेलुलर प्रक्रिया के कैंसर में angiogenesis समर्थन की बातचीत आगे स्पष्ट किया जा सकता है। इन विशेष परिस्थितियों में endothelial कोशिकाओं से शाही सेना और प्रोटीन की निकासी के अतिरिक्त मात्रात्मक डेटा डेटा इमेजिंग के लिए इसी प्रदान करते हैं।

Materials

EGM-2 complete growth medium (EGM-2 bullet kit CC-3162 )	Fisher	NC9525043	HUVEC complete growth medium: EGM-2 base medium mixed with BBE (Bovine Brain Extract), hEGF (Human Epidermal Growth Factor), Hydrocortisone, GA-1000 (Gentamicin, Amphotericin-B), 2% FBS (Fetal Bovine Serum), VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), hFGF-β (Human Fibroblast Growth Factor Beta), R3-IGF-1 (Long R Insulin-like Growth Factor One), Ascorbic Acid, and Heparin.  Aliquot the medium and its components and store them at -20 oC, warm  in 37 oC  before use.
MATRIGEL MATRIX 10ML Growth Factor Reduced (GFR); 10mL; LDEV-Free	Fisher	CB-40230	Growth Factor Reduced (GFR) extracellular matrix, keep in   -20 oC , warm in 4 °C  before use.
MATRIGEL MATRIX 10ML ; 10mL; LDEV-Free	Fisher	CB-40234	extracellular matrix, keep in   -20 oC, warm in 4 °C  before use.
SB225002	Fisher	559405	CXCR2 inhibitor, keep in   -20 oC, warm in room temperature  before use.
Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)	ScienCell Research Laboratories	8000	culture it according reference  10.
Trypsin 0.05%-EDTA phenol red	Invitrogen	25300-054	keep in 4 oC, warm  in 37 oC  before use.
Nikon ECLIPSE Ti	Nikon		Inverted Research Microscope.
NIS-Elements AR 4.20.02 64 bit	Nikon		Inverted Research Microscope software
Graph-pad Prism 5	GraphPad Software, Inc.		scientific 2D graphing and statistics software, to calculate IC50.