This manuscript describes a tube formation assay to quantify the effects of a given compound or condition on angiogenesis by using endothelial cell tube formation in a controlled environment.
Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient’s blood stream by hijacking the process of angiogenesis, in which new blood vessels are formed from existing blood vessels. The CXCR2 (chemokine (C-X-C motif) receptor 2) receptor is a transmembrane G-protein-linked molecule found in many cells that is closely associated with angiogenesis1. Specific blockade of the CXCR2 receptor inhibits angiogenesis, as measured by several assays such as the endothelial tube formation assay. The tube formation assay is useful for studying angiogenesis because it is an excellent method of studying the effects that any given compound or environmental condition may have on angiogenesis. It is a simple and quick in vitro assay that generates quantifiable data and requires relatively few components. Unlike in vivo assays, it does not require animals and can be carried out in less than two days. This protocol describes a variation of the extracellular matrix supporting endothelial tube formation assay, which tests the CXCR2 receptor.
For å oppnå de næringsstoffer som er nødvendig for å overleve, maligne tumorer krever adgang til pasientens blodstrøm. For å få tilgang til det, tumorceller frigjør kjemiske signaler som stimulerer veksten av nye blodkar i tumoren, og dermed kapre den normale fysiologiske prosess som er kjent som angiogenese 2. Det er også gjennom blodårene opprettet via angiogenese at metastase (dvs. spredning av kreft til andre organer) kan forekomme. Fordi prosessen med angiogenese er så viktig for utviklingen av en slik rekke kreftformer, er det et attraktivt mål i anticancerterapi forskning 3.
En metode som brukes til å kvantifisere angiogenese er å måle endotel progenitor-cellens evne til å danne rør når den plasseres på en ekstracellulær matriks. Ettersom dannelsen av disse rør er en kritisk tidlig trinn i angiogenese, testing av miljøbetingelser (for eksempel, tilstedeværelse eller mangel på en gitt compound) som kan stimulere eller hemme tube dannelse gir innsikt i konkrete tiltak som kan være målrettet for å hemme angiogenese. Endotelcelle røret dannelsesbestemmelsen er en av de mest brukte 4 in vitro metoder som måler cellenes evne til å danne rør. Det er en enkel analyse, noe som krever forholdsvis få komponenter og en kort kulturperiode 5. Kanskje aller viktigst, er imidlertid at dataene oppnådd fra denne type analyse er målbare.
Et eksempel for anvendelse av røret formasjonen analysen er å sammenligne utviklingen av rørene fra vaskulære endotelceller dyrket på ekstracellulær matriks vs. vekstfaktor reduseres (GFR) ekstracellulære matriks. Den ekstracellulære matriks er et basalmembran-liknende materiale isolert fra sarkomceller og dets hovedkomponenter er laminin, kollagen type IV, vekstfaktorer og proteoglykaner. Noen forbindelser har ulik effekt på cellenes evne til å danne rør når iet miljø med reduserte vekstfaktorer og reduserte heparansulfat proteoglykaner (HSPGs). HSPGs er en komponent av den ekstracellulære matriks som er betydelig redusert i GFR ekstracellulær matriks. Som et eksempel, hvis den hypotese er at angiogenese-inhibitorer, slik som SB225002, som blokkerer CXCR2 reseptoren, har vesentlig svakere evne til å avbryte rør dannelse når HSPGs er rikelig, og deretter en sammenligning mellom rør formasjon aktivitet i ekstracellulære matriks og GFR ekstracellulære matriks er viktig i å utforske muligheten for angiogenese hemming via kontroll av HSPGs.
Andre analyser som ofte brukes for å bestemme effektene av forbindelsene på angiogenese er in vivo metoder. Kjente eksempler på dette er dama chorioallantoic membran (CAM) assay 6 bruker kylling egg, og in vivo Matrigel plugg angiogenese analysen 7 ved hjelp av mus. Mens in vivo metoder måle angiogenese i three dimensjoner og er mer representative for den menneskelige kroppen sammenlignet med in vitro-rør-analysen, lider de av den feil at den krever betydelig mer tid og er betydelig mer vanskelig å utføre. Både CAM-testen og den ekstracellulære pluggen analysen ta minst en uke 8 for å gjøre, mens i sammenligning, kan røret dannelsesbestemmelsen gjøres i en enkelt dag, og det krever ikke animalsk bruk.
Det er viktig å merke seg at endotelcellene som brukes i denne rapport er humane navlestrengvene endotelialceller (HUVEC). Disse cellene spiller en sentral rolle i vaskulære spire og vekst av blodkar, og er tilstrekkelig analog til endotelceller i krefttyper som skal benyttes for å vurdere anti-angiogenese aktivitet både in vitro og in vivo eksperimenter 9. Andre celler så som primære mikrovaskulære endotelceller kan også anvendes.
Det er også viktig å merke seg at i tillegg til å ha laverenivåer av HSPGs, har GFR ekstracellulære matriks også reduserte nivåer av mange komponenter i forhold til det normale ekstracellulære matriks. Dette omfatter, men er ikke begrenset til: EGF, IGF-1, PDGF, og TGF-beta. De utfører eksperimenter studerer betydningen av disse forbindelsene i forhold til angiogenese kan være interessert i å bruke GFR ekstracellulære matrise.
Ved å gjennomføre denne analysen, er det viktig å holde den ekstracellulære matriks på is eller ved 4 ° C til alle tider mindre annet er spesifisert. Dersom den ekstracellulære matriks tillates å oppvarmes over 4 ° C, vil den polymerisere, og analysen vil bli ødelagt. Det er også viktig å sikre at alt som kommer i kontakt (f.eks, pipettespisser, plate) med den ekstracellulære matriks er forhåndskjølt til den ovennevnte grunn. Antall celler utsådd i hver brønn er kritisk, vil også få celler ikke gi den forventede nettet i kontrollprøven, for mange celler vil danne store cellegrupper, eller et monolag, og analysen vil ikke være gyldig. En annen viktig faktor i suksessen til denne analysen er cellen passasje nummeret til HUVECs. Passasjen nummer skal alltid være lavere enn ti, ellers kan ikke forekomme robust tube formasjon. I tillegg bør man sørge for at cellekulturmedium som brukes ikke er utløpt, eller cellene vil ikke være levedyktig. alternatively, kan en delmengde mediet og dets komponenter og lagre dem ved -20 ° C for å bevare for en periode av tid etter utløpsdatoen. Selvfølgelig er det fortsatt foretrekke å bruke mediet før utløpsdato
Som alle fremgangsmåter, er det noen ulemper for gjennomføring av endotelcelle røret formasjonsanalyse. Et stort problem er at, fordi det finnes forskjellige typer av endotelceller og støtte matriser, kan resultatene av analysen variere sterkt avhengig av hvilken celletype og matriks anvendt. Endotelcellene brukes (HUVECs, HAECs eller HMVECs) er primære celler, de er kostbare å få og ha variasjon i forhold til udødelig celler. Den primære celler har begrensede passasjer for bruk, og er derfor ikke egnet for langsiktig angiogenese eksperimenter 14. For pålitelige data, bør man alltid bruke de samme typene for analysen. Som med andre in vitro-analyser, bør resultatene av et rør formasjon assay være conbekreftet in vivo, fordi resultater fra de kontrollerte og kunstige forhold med to-dimensjonal vevskultur ikke alltid bli reflektert i komplekset Biosystem av en levende organisme. Det er også viktig å huske på at denne type av test kan bare brukes for å demonstrere endotelcelle rør formasjon, og skal ikke benyttes til å teste andre, ikke-endotel, rør dannende celler.
Denne analysen er en relativt enkel og rask metode for å kvantifisere angiogenic potensialet av en forbindelse. Den danner også en plattform for videre eksperimenter, som alene, vil det ikke gi informasjon angående den spesielle mekanisme ved hjelp av hvilken forbindelsen faktisk påvirker fartøyet formingsprosessen. Imidlertid er bruken av variert ekstracellulære matriser et eksempel på hvordan man videre legge til rette for problemstillinger som ikke er vanlig brukt. Det er tilnærminger til å studere de spesifikke biokjemiske mekanismer i forbindelse inkludert spesifikke hemmere som er rettet mot komponenter avden angiogenese pathway. En annen tilnærming kan være å ekstrahere RNA fra endotelceller og bruke RT-PCR (Real Time PCR) 12 for å analysere endringer i genekspresjon som kan forårsake vekst oppførsel observert i analysen. Fremtidige anvendelser av denne fremgangsmåte omfatter transfektert HUVECs for å skape knock-down-analyser for bestemte trinn av angiogenese pathway. Det er potensial for å bruke denne tilnærmingen til å studere lymphangiogenesis veien. Ved å endre de ekstracellulære matriks-komponenter, kan vekselvirkningen mellom matrisen og cellulær prosess støtte angiogenese i kreft bli ytterligere belyst. Utvinning av RNA og proteiner fra endotelceller under disse spesielle forhold gi ytterligere kvantifiserbare data tilsvarende bildebehandling data.
The authors have nothing to disclose.
The work was funded by the Fund for Medical Research and Education, Wayne State University, Detroit, MI.
EGM-2 complete growth medium (EGM-2 bullet kit CC-3162 ) | Fisher | NC9525043 | HUVEC complete growth medium: EGM-2 base medium mixed with BBE (Bovine Brain Extract), hEGF (Human Epidermal Growth Factor), Hydrocortisone, GA-1000 (Gentamicin, Amphotericin-B), 2% FBS (Fetal Bovine Serum), VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), hFGF-β (Human Fibroblast Growth Factor Beta), R3-IGF-1 (Long R Insulin-like Growth Factor One), Ascorbic Acid, and Heparin. Aliquot the medium and its components and store them at -20 oC, warm in 37 oC before use. |
MATRIGEL MATRIX 10ML Growth Factor Reduced (GFR); 10mL; LDEV-Free | Fisher | CB-40230 | Growth Factor Reduced (GFR) extracellular matrix, keep in -20 oC , warm in 4 °C before use. |
MATRIGEL MATRIX 10ML ; 10mL; LDEV-Free | Fisher | CB-40234 | extracellular matrix, keep in -20 oC, warm in 4 °C before use. |
SB225002 | Fisher | 559405 | CXCR2 inhibitor, keep in -20 oC, warm in room temperature before use. |
Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | ScienCell Research Laboratories | 8000 | culture it according reference 10. |
Trypsin 0.05%-EDTA phenol red | Invitrogen | 25300-054 | keep in 4 oC, warm in 37 oC before use. |
Nikon ECLIPSE Ti | Nikon | Inverted Research Microscope. | |
NIS-Elements AR 4.20.02 64 bit | Nikon | Inverted Research Microscope software | |
Graph-pad Prism 5 | GraphPad Software, Inc. | scientific 2D graphing and statistics software, to calculate IC50. |