Моделирование миотонической дистрофии 1 в C2C12 миобластов клеток
Summary
В этом протоколе, мы приводим процедуры создания Миотоническая дистрофия 1 миобластов моделей, в том числе оптимизированного обслуживания С2С12 клеток, генной трансфекции / трансдукции и миоцитов дифференциации.
Abstract
Миотоническая дистрофия 1 (DM1) является распространенной формой мышечной дистрофии. Хотя некоторые модели на животных были установлены для DM1, миобластов модели клеток по-прежнему важны, поскольку они обеспечивают эффективную клеточную альтернативу для изучения клеточных и молекулярных событий. Хотя клетки миобластов С2С12 широко используется для изучения миогенез, устойчивость к трансфекции генов или вирусной трансдукции, затрудняет исследование в клетках С2С12. Здесь мы опишем оптимизированный протокол, который включает в себя ежедневное техническое обслуживание, Трансфекция и трансдукции процедуры для введения генов в С2С12 миобластов и индукции дифференцировки кардиомиоцитов. Итак, эти процедуры позволяют наилучшие эффективности трансфекции / трансдукции, а также последовательные результаты дифференциации. Протокол, описанный в создании моделей DM1 миобластов клеток пойдет на пользу изучение миотоническая дистрофии, а также других мышечных заболеваний.
Introduction
Миотоническая дистрофия (DM) является аутосомно – доминантным заболеванием , которое затрагивает несколько систем, наиболее особенно сердечной и скелетных мышц 1. Есть два подтипа этого заболевания, DM1 и DM2. DM1 является более распространенным и имеет более тяжелое проявление чем СД2 2. Генетическая мутация , лежащая в основе DM1 является расширением CUG триплетных повторов , расположенных в нетранслируемой области 3 '(УТР) ДМ гена протеинкиназы (ДМПК) 3. Число ЗГП повтора в непораженных особей колеблется от 5 до 37. В отличие от этого , она возрастает до более чем 50, а иногда и до тысяч у больных DM1 4. В результате РНК-связывающие белки, такие как muscleblind типа 1 (MBNL1), CUGBP и Elav типа семейство 1 (Celf1), являются misregulated. Из – за секвестрации на расширенном CUG повторами, MBNL1 теряет способность регулировать альтернативного сплайсинга 5. Celf1, с другой стороны, до регулируемой 6,7. Сверхэкспрессия Celf1 связано с потерей мышечнойи слабость, которые не отнесены к потере функции MBNL1. Животные модели, имитирующие DM1-связанных изменений, в том числе ДМПК 3'-UTR расширения СГГ, потеря MBNL1 и избыточная экспрессия Celf1, были установлены. Тем не менее, моделирование DM1 в миобластов предлагает эффективную альтернативу, особенно для рассечения DM1 связанных клеточных и молекулярных событий.
C2C12 миобластов линия клеток впервые был выделен из поврежденной мышцы С3Н мыши и широко используются для изучения миогенной дифференцировки 8,9. C2C12 клетки быстро размножаются в эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) -содержащий средства массовой информации и легко подвергаются дифференцировке, когда ФБС истощается. Тем не менее, с помощью этой миобластов дифференциации модель представляет две задачи: C2C12 клетки часто устойчивы к трансфекции генов / вирусной трансдукции; и небольшие изменения в обработке клеток и дифференцировки процедуры может привести к заметным изменениям в образовании myotube.
Наша лаборатория обычно использует С2С12 миобластов как асELL модель и разработала протоколы , которые эффективно обеспечивают гены от плазмиды трансфекции, ретровирусной трансдукции и лентивирусов трансдукции в клеточной линии С2С12 10. В видео мы покажем, оптимизированные процедуры для трансфекции / трансдукции С2С12 клеток и поддержание согласованности дифференциации в создании моделей DM1 миобластов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Клеточная линия C2C12 была использована в качестве модели для изучения миогенез 11-14. Эти клетки сохраняют фибробластоподобных внешний вид, быстро пролиферируют в среде , содержащей 20% фетальной бычьей сыворотки и легко дифференцировать в среде , содержащей 2% лошадиной сыворотки , <su…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Drs. Tom Cooper from the Baylor College of Medicine, Mani S. Mahadevan from the University of Wisconsin-Madison, and Didier Trono from the University of Geneva for reagents. This work is supported by a University of Houston startup fund (YL), American Heart Association grant (YL, 11SDG5260033), and the National Natural Science Foundation of China (XP, 81460047).
Materials
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 11965-084 | for culture medium |
| Fetal Bovine Serum – Premium | Atlanta Biologicals | S11150 | for culture medium |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Life Technologies | 10378-016 | for culture medium |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma Aldrich | I6634-100MG | for differentiation medium |
| equine serum | Atlanta Biologicals | S12150 | for differentiation medium |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | for transfection |
| G418 sulfate | Gold Biotechnology | G-418-10 | for drug resistant selection |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma Aldrich | sc-108071 | for drug resistant selection |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | for western blot |
| NuPAGE Transfer Buffer (20X) | Life Technologies | NP00061 | for western blot |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20X) | Life Technologies | NP0002 | for western blot |
| Amersham Protran Supported 0.2 NC, 300mmx4m | GE healthcare life science | 10600015 | for western blot |
| MF 20 | Developmental Hybridoma Bank | MF 20 | primary Ab for immunostaining |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Texas Red-X conjugate | Thermo Fisher Scientific | T-862 | secondary Ab for immunostaining |
| One step qRT-PCR MasterMix | AnaSpec | 05-QPRT-032X | for qRT-PCR |
| TriPure Isolation Reagent | Roche | 11667165001 | for RNA isolation |
| CUG-BP1 Antibody (3B1) | santa cruz | sc-20003 | primary Ab western blot |
| Actin Antibody | santa cruz | sc-1615 | goat polyclonal IgG for loading control |
| 293T Ecopack | Clontech | 631507 | cells for retrovirus preparation |
| pMSCV-puro | Clontech | 634401 | empty retroviral vector for retrovirus preparation |
| pMSCV-Celf1Flag-puro | house-constructed | not available | retroviral vector encoding Celf1Flag, used in retrovirus preparation |
| psPAX2 | gift from Didier Trono | not available | for lentivirus preparation |
| pMD2.G | gift from Didier Trono | not available | for lentivirus preparation |
| GFP-CUG5 | gift from M.S. Mahadevan | not available | details in reference 10 |
| GFP- CUG200 | gift from M.S. Mahadevan | not available | details in reference 10 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | for immunostaining |
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | for immunostaining |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P9416 | for immunostaining |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | for immunostaining |
References
- Harper, P. S. . Myotonic dystrophy. 3rd edn. , (2001).
- Timchenko, L. Molecular mechanisms of muscle atrophy in myotonic dystrophies. Int J Biochem Cell Biol. 45 (10), 2280-2287 (2013).
- Brook, J. D., et al. Molecular basis of myotonic dystrophy: expansion of a trinucleotide (CTG) repeat at the 3′ end of a transcript encoding a protein kinase family member. Cell. 68 (4), 799-808 (1992).
- Chau, A., Kalsotra, A. Developmental insights into the pathology of and therapeutic strategies for DM1: Back to the basics. Dev Dyn. 244 (3), 377-390 (2015).
- Ho, T. H., et al. Muscleblind proteins regulate alternative splicing. EMBO J. 23 (15), 3103-3112 (2004).
- Kuyumcu-Martinez, N. M., Wang, G. S., Cooper, T. A. Increased steady-state levels of CUGBP1 in myotonic dystrophy 1 are due to PKC-mediated hyperphosphorylation. Mol Cell. 28 (1), 68-78 (2007).
- Kalsotra, A., et al. The Mef2 transcription network is disrupted in myotonic dystrophy heart tissue, dramatically altering miRNA and mRNA expression. Cell Rep. 6 (2), 336-345 (2014).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
- Blau, H. M., Chiu, C. P., Webster, C. Cytoplasmic activation of human nuclear genes in stable heterocaryons. Cell. 32 (4), 1171-1180 (1983).
- Peng, X., et al. Celf1 regulates cell cycle and is partially responsible for defective myoblast differentiation in myotonic dystrophy RNA toxicity. Biochim Biophys Acta. 1852 (7), 1490-1497 (2015).
- Amack, J. D., Mahadevan, M. S. The myotonic dystrophy expanded CUG repeat tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast differentiation. Hum Mol Genet. 10 (18), 1879-1887 (2001).
- Amack, J. D., Paguio, A. P., Mahadevan, M. S. Cis and trans effects of the myotonic dystrophy (DM) mutation in a cell culture model. Hum Mol Genet. 8 (11), 1975-1984 (1999).
- Bhagavati, S., Shafiq, S. A., Xu, W. (CTG)n repeats markedly inhibit differentiation of the C2C12 myoblast cell line: implications for congenital myotonic dystrophy. Biochim Biophys Acta. 1453 (2), 221-229 (1999).
- Amack, J. D., Mahadevan, M. S. Myogenic defects in myotonic dystrophy. Dev Biol. 265 (2), 294-301 (2004).
- Emerson, C. P., Sweeney, H. L. . Methods in muscle biology. 52, (1997).
- Ward, A. J., Rimer, M., Killian, J. M., Dowling, J. J., Cooper, T. A. CUGBP1 overexpression in mouse skeletal muscle reproduces features of myotonic dystrophy type 1. Hum Mol Genet. 19 (18), 3614-3622 (2010).
- Koshelev, M., Sarma, S., Price, R. E., Wehrens, X. H. T., Cooper, T. A. Heart-specific overexpression of CUGBP1 reproduces functional and molecular abnormalities of myotonic dystrophy type 1. Hum Mol Genet. 19 (6), 1066-1075 (2010).
