एक दृष्टिकोण संरेखण और पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स की myelination बढ़ाने के लिए
Summary
This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.
Abstract
Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.
Introduction
तंत्रिका चोटों में, समीपस्थ और बाहर का तंत्रिका स्टंप अक्सर घाव साइट 1-2 के कारण तंत्रिका fascicles के प्रत्यक्ष फिर से संगठित करना से रोका जाता है। आम तौर पर, अक्षतंतु इलाकों axons की अत्यधिक आदेश दिया है और गठबंधन बंडलों, जो कनेक्टिविटी के जटिल नेटवर्क के रूप में बना रहे हैं। हालांकि, तंत्रिका उत्थान खराब का आयोजन अक्षतंतु संरेखण 3-4 के कारण एक अराजक प्रक्रिया है। इसलिए, एक्सोन कि घाव साइट को पाटने regenerating के लिए पर्याप्त संख्या में उत्पन्न करने के लिए है, यह अच्छी तरह से आयोजित axonal संरेखण प्रेरित करने के लिए आवश्यक है। इसके अतिरिक्त, माइलिन रहित चोट साइट पर myelinating कोशिकाओं की मौत के कारण तंत्रिका चोटों के साथ जुडा हुआ। चूंकि माइलिन रहित जोरदार एक्सोन जीवित रहने की क्षमता को बाधित प्रवाहकीय, माइलिन रहित लक्षित या remyelination को बढ़ावा देने के उपचार तंत्रिका चोट के बाद 5 कार्यात्मक वसूली के लिए महत्वपूर्ण हैं। इस प्रकार इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य के एक इंजीनियरिंग दृष्टिकोण है कि इन दो मुद्दों के पते वर्णन करने के लिए हैतंत्रिका उत्थान की।
भूतल anisotropy, जब विभिन्न कुल्हाड़ियों साथ मापा, एक सामग्री के भौतिक या यांत्रिक गुणों में है, जो एक अंतर के रूप में परिभाषित किया गया है, सेल संरेखण, विकास, और प्रवास 6-7 प्रभावित करने के लिए लागू किया गया है। स्थलाकृति के अलावा, वहाँ अन्य तरीकों anisotropy प्रेरित करने के लिए कर रहे हैं। इससे पहले, हम सतह anisotropy पाली डाइमिथाइल-siloxane (PDMS) झिल्ली के यांत्रिक स्थिर पूर्व खंड से प्रेरित जांच की। "छोटे विरूपण सुपर बड़े पर लगाया" के सिद्धांत भविष्यवाणी की है कि प्रभावी कठोरता कोशिकाओं बढ़ाकर दिशा में भावना सीधा दिशा से अलग है, और प्रभावी कठोरता में इस अंतर anisotropy 8 सतह के कारण है। Mesenchymal स्टेम सेल (MSCs) एक पूर्व बढ़ाकर PDMS झिल्ली पर सुसंस्कृत, सक्रिय रूप से सतह खींच कर और एक परिणाम के रूप में anisotropy भावना पूर्व बढ़ाकर दिशा 9 में संरेखित करने में सक्षम हैं। इसी तरह, एक anisotropic सतह की गिरफ्तारीएक यांत्रिक पूर्व बढ़ाकर सतह से आइसिंग संरेखण, साथ ही विकास और myelination पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि के (डीआरजी) एक्सोन 10 प्रभावित करता है। यहाँ हम एक स्थिर पूर्व बढ़ाकर PDMS सब्सट्रेट पर सतह anisotropy उत्प्रेरण अक्षतंतु उत्थान 10 बढ़ाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।
अक्षतंतु संरेखण, वांछित पैटर्न के साथ topological सुविधाओं को प्रकाश में लाना करने के लिए, गठबंधन फाइबर और चैनलों के माध्यम से संपर्क 6,11-12 मार्गदर्शन प्रदान करने के लिए सूचना, अक्षतंतु संरेखण 11,13 की सुविधा के लिए प्रदर्शन किया गया। हालांकि, इस तरह के फाइबर, चैनलों और patterning के रूप में topological सुविधाओं, के माध्यम से अक्षतंतु संरेखण उत्प्रेरण के लिए तकनीक की सूचना दी, लंबा और एक्सोन की मोटाई में वृद्धि करने में असमर्थ थे। इसके विपरीत, क्रमिक मैकेनिकल अब और गहरा एक्सोन कि खंड 14 की भयावहता के साथ बढ़ के साथ खिंचाव दिशा में अक्षतंतु संरेखण के लिए नेतृत्व खींच। हालांकि, विवो में एक मोटर संचालित डिवाइस को शामिल नहीं हैसंभव। इसके विपरीत, स्थिर पूर्व बढ़ाकर प्रेरित anisotropy कम जटिल है और अधिक आसानी से इन विवो अनुप्रयोगों के लिए भविष्य पाड़ डिजाइन में शामिल किया जा सकता है।
इस प्रोटोकॉल में, एक स्थिर पूर्व बढ़ाकर सेल संस्कृति प्रणाली topological सुविधाओं के बिना सतह anisotropy प्रेरित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। पूर्व बढ़ाकर संस्कृति प्रणाली, एक PDMS झिल्ली, एक stretchable फ्रेम और एक खींच चरण की रचना की जिस झिल्ली फ्रेम पर तय हो गई है और एक पूर्व निर्धारित खिंचाव परिमाण खींच मंच पर लागू किया जाता है। हौसले से पृथक डीआरजी अप करने के लिए 21 दिनों के लिए पूर्व बढ़ाकर सतह पर सभ्य न्यूरॉन्स अक्षतंतु संरेखण और मोटाई के लिए निगरानी कर रहे हैं। बाद में, श्वान कोशिकाओं (एससी) गठबंधन एक्सोन myelination के लिए निगरानी कर रहे हैं के साथ सह सुसंस्कृत। पूर्व खंड प्रेरित सतह anisotropy को शामिल करके हम MSCs और डीआरजी न्यूरॉन्स 9-10 क्रमश: सेल संरेखण-भेदभाव और अक्षतंतु संरेखण-विकास को बढ़ाने में सक्षम थे।
Protocol
Representative Results
Discussion
पूर्व बढ़ाकर सतह पर अक्षतंतु संरेखण के लिए प्रेरित करने के लिए, वहाँ दो महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं: 1) PDMS झिल्ली सपाट होना चाहिए और समरूप मोटाई की; और 2) glial कोशिकाओं डीआरजी से हटा दिया जाना चाहिए। PDMS और crosslinker मिश्…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों PDMS substrates की तैयारी में उसकी सहायता के लिए एरिक वास्को का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, उपयोगी सुझाव और डीआरजी अलगाव के प्रशिक्षण के लिए मिशिगन विश्वविद्यालय में डॉ मरीना माता की लैब में डॉ Shiyong वैंग, और डॉ मार्क Tuszynski और डॉ । यूसी सैन डिएगो में डब्ल्यू मैरी Campana अनुसूचित जाति अलगाव के लिए उपयोगी सुझाव और प्रोटोकॉल के लिए। इस अध्ययन में राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (CBET 0941055 और 1510895 CBET), स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (R21CA176854, R01GM089866, और R01EB014986) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Polydimethylsiloxane （PDMS) | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
| Neurobasal Medium 1X | GibcoBRL | 21103-049 | |
| B27 Supplement 50X | GibcoBRL | 17504-044 | |
| Glutamax-I 100X | GibcoBRL | 35050-061 | |
| Albumax-I | GibcoBRL | 11020-021 | |
| Nerve Growth Factor-7S | Invitrogen | 13290-010 | |
| Penicillin-streptomycin | GibcoBRL | 15140-122 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA/1mM EDTA | GibcoBRL | 25300-054 | |
| Poly-L-Lysine | Trevigen | 3438-100-01 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | p-6407 | |
| Fluoro-2 deoxy-uridine | Sigma | F0503 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14170-112 | Isolation Buffer |
| Type I Collagenase | Worthington | LS004196 | |
| DMEM | Gibco | 11885 | |
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30080.03 | |
| BPE | Clonetics | CC-4009 | |
| Forskolin | Calbiochem | 344270 | |
| Silicone chamber | Greiner bio-one | FlexiPERM ConA | |
| Plasma cleaning/etching system | March Instruments | PX-250 | |
| Anti-Thy 1.1 antibody | Sigma- Aldrich | M7898 | |
| Rabbit Complement | Sigma- Aldrich | S-7764 | |
| Standard growth medium | For 500 ml Neurobasal Medium 1X, add 10 ml of B-27 50X, 5 ml of Glutamax-I 100X, | ||
| 2.5 ml of Penicillin/Streptomycin (Penn/Strep), 1 ml of Albumax-I, and 1 μl of NGF– 7S (50 ug/ml). | |||
| FDU and Uridine stock solution | FDU 100mg in 10ml of ddw (10mg/ml), filter in the hood and divided in 500ul aliquots and store at -20 ºC. | ||
| Uridine 5g in 166.7ml of ddw (33mg/ml), filter in hood, divide in 200ul aliquots and store at -20 ºC. | |||
| Take 61.5ul of FDU (10mg/ml) and 20.5ul of Uridine(33mg/ml), and add 4918ul of ddw to a final stock concentration, | |||
| then divide in 1 ml aliquots and store at -20 ºC. |
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