Une approche pour améliorer l'alignement et myélinisation de ganglion de racine dorsale Neurones

Summary

This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.

Abstract

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.

Introduction

Dans les lésions nerveuses, les proximale et distale nerveuses souches sont souvent empêchés de réalignement direct des faisceaux nerveux en raison du site de la lésion ^1-2. Normalement, les secteurs de l'axone sont composés de faisceaux hautement ordonnés et alignés d'axones qui forment des réseaux complexes de connectivité. Cependant, la régénération nerveuse est un processus chaotique due à l' alignement de l' axone mal organisé ^3-4. Par conséquent, afin de générer un nombre suffisant de régénération d'axones qui relient le site de la lésion, il est nécessaire d'induire un alignement axonale bien organisé. En outre, la démyélinisation accompagne les lésions nerveuses dues à la mort des cellules myélinisantes au site de la lésion. Depuis démyélinisation affecte fortement la capacité conductrice des axones survivants, traitements ciblant la démyélinisation ou la promotion de la remyélinisation sont importantes pour la récupération fonctionnelle après lésion du nerf ^5. Ainsi, l'objectif de ce protocole est d'illustrer une approche d'ingénierie qui répond à ces deux questionsde la régénération nerveuse.

Anisotropie de surface, qui est définie comme une différence, lorsqu'elle est mesurée le long d' axes différents, des propriétés physiques ou mécaniques d'un matériau, a été appliqué pour influencer l' alignement des cellules, la croissance et la migration ^6-7. En plus de la topographie, il existe d'autres méthodes pour induire une anisotropie. Auparavant, nous avons étudié l'anisotropie de surface induite par mécanique pré-étirement statique de poly-diméthyl-siloxane (PDMS) membrane. La théorie de la "petite super déformation imposée sur une grande" prédit que la rigidité effective des cellules détectent dans le sens étiré diffère de la direction perpendiculaire, et cette différence de rigidité effective est due à la surface anisotropie ^8. Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) cultivées sur une membrane PDMS pré-étiré sont capables de détecter l'anisotropie en tirant sur ​​la surface active et en conséquence, d' aligner la direction pré-étiré ^9. De même, une surface ar anisotropiqueising à partir d' une surface pré-étiré mécanique affecte l'alignement, ainsi que la croissance et la myélinisation du ganglion de la racine dorsale (DRG) axones ^10. Ici , nous fournissons un protocole destiné à induire une anisotropie de surface sur un substrat pré-étiré statique PDMS pour améliorer la régénération axonale ^10.

Pour obtenir l' alignement des axones, des caractéristiques topologiques avec des motifs souhaités, rapporté à fournir des conseils de contact à travers des fibres et des canaux ^6,11-12 alignés, ont été démontrées pour faciliter l' alignement des axones ^11,13. Cependant, les techniques permettant d'induire un alignement des axones par les caractéristiques topologiques, telles que des fibres, des canaux et des motifs rapportés, ont été incapables d'allonger et d'augmenter l'épaisseur des axones. En revanche, progressive étirage mécanique a conduit à l' alignement des axones dans la direction d'étirement avec axones longs et plus épais que l' augmentation de l'amplitude du tronçon ^14. Cependant, incorporant un dispositif de moteur alimenté in vivo est pasfaisable. En revanche, statique anisotropie induite pré-étiré est moins compliqué et peut être plus facilement incorporé dans les futures conceptions d'échafaudage pour des applications in vivo.

Dans ce protocole, un système de culture de cellules pré-étiré statique est utilisé pour induire une anisotropie de surface sans caractéristiques topologiques. Le système de culture pré-étiré est constitué d'une membrane PDMS, un cadre extensible et un étage d'étirage, après quoi la membrane est fixée sur le châssis et un tronçon de grandeur prédéterminée est appliquée à l'étape d'étirage. neurones DRG fraîchement isolées en culture sur la surface pré-étiré jusqu'à 21 jours sont contrôlés pour l'alignement et de l'épaisseur axone. Par la suite, les cellules de Schwann (SC) co-cultivées avec les axones alignés sont surveillés pour la myélinisation. En incorporant de pré-étirement induite surface anisotropie , nous avons pu améliorer la cellule alignement différenciation et axone alignement de croissance des cellules souches mésenchymateuses et les neurones DRG ^9-10, respectivement.

Protocol

Toutes les procédures pour l'isolement des cellules ont été approuvées par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle à Michigan State University. 1. Préparation des pré-étiré Surface anisotrope Mélanger 10: 1 solution de base et l'agent de durcissement et de verser le mélange dans une boîte de culture tissulaire (12 cm de diamètre). Utilisez 4,900 mg de base et 490 mg d'agent de durcissement pour le mélange de réticulation totale. Mainten…

Representative Results

Le système de culture de cellules pré-étiré promu l' alignement de l' axone 10 DRG. neurones DRG ont été cultivées sur des surfaces pré-étirées et non étirées pendant 12 jours. Les axones ont été colorées pour β-III-tubuline pour démontrer leur alignement. La figure 2 compare l' orientation des axones sur les PDMS pré-étirées et non étirées substrats après 12 jours de culture. Les axones DRG alignés parallèlement à la dire…

Discussion

Pour induire l'alignement axone sur la surface pré-étiré, il y a deux étapes essentielles: 1) la membrane PDMS doit être plat et d'épaisseur homogène; et 2) les cellules gliales doivent être retirés de la DRG. Après le mélange des PDMS et réticulant et le durcissement dans un four, le gel de PDMS réticulé doit être conservé sur un dessus de banc plat et manipulé avec précaution pour éviter tout basculement. Le traitement par plasma d'oxygène de la membrane PDMS doit être suivie dans les …

Materials

Polydimethylsiloxane （PDMS)	Dow Corning	SYLGARD 184
Neurobasal Medium 1X	GibcoBRL	21103-049
B27 Supplement 50X	GibcoBRL	17504-044
Glutamax-I 100X	GibcoBRL	35050-061
Albumax-I	GibcoBRL	11020-021
Nerve Growth Factor-7S	Invitrogen	13290-010
Penicillin-streptomycin	GibcoBRL	15140-122
0.05% Trypsin-EDTA/1mM EDTA	GibcoBRL	25300-054
Poly-L-Lysine	Trevigen	3438-100-01
Poly-D-Lysine	Sigma	p-6407
Fluoro-2 deoxy-uridine	Sigma	F0503
Uridine	Sigma	U3003
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Invitrogen	14170-112	Isolation Buffer
Type I Collagenase	Worthington	LS004196
DMEM	Gibco	11885
Heat inactivated Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30080.03
BPE	Clonetics	CC-4009
Forskolin	Calbiochem	344270
Silicone chamber	Greiner bio-one	FlexiPERM ConA
Plasma cleaning/etching system	March Instruments	PX-250
Anti-Thy 1.1 antibody	Sigma- Aldrich	M7898
Rabbit Complement	Sigma- Aldrich	S-7764
Standard growth medium			For 500 ml Neurobasal Medium 1X, add 10 ml of B-27 50X, 5 ml of Glutamax-I 100X,
			2.5 ml of Penicillin/Streptomycin (Penn/Strep), 1 ml of Albumax-I, and 1 μl of NGF– 7S (50 ug/ml).
FDU and Uridine stock solution			FDU 100mg in 10ml of ddw (10mg/ml), filter in the hood and divided in 500ul aliquots and store at -20 ºC.
			Uridine 5g in 166.7ml of ddw (33mg/ml), filter in hood, divide in 200ul aliquots and store at -20 ºC.
			Take 61.5ul of FDU (10mg/ml) and 20.5ul of Uridine(33mg/ml), and add 4918ul of ddw to a final stock concentration,
			then divide in 1 ml aliquots and store at -20 ºC.