Uma abordagem para reforçar Alinhamento e mielinização do gânglio de raiz dorsal neurônios

Summary

This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.

Abstract

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.

Introduction

Em lesões nervosas, os cotos proximal e distal do nervo são muitas vezes impedidos de realinhamento direta dos fascículos nervosos devido ao local da lesão ^1-2. Normalmente, intervalos de axônios são compostos por feixes altamente ordenadas e alinhadas de axônios, que formam complexas redes de conectividade. No entanto, a regeneração do nervo é um processo caótico devido ao alinhamento axônio mal organizado ^3-4. Por isso, para gerar um número suficiente de regeneração de axónios que preenchem o local da lesão, é necessário para induzir o alinhamento axonal bem organizada. Além disso, a desmielinização acompanha lesões nervosas devido à morte das células mielinizantes no local da lesão. Desde desmielinização prejudica fortemente a capacidade condutora de sobreviver axônios, os tratamentos visam desmielinização ou promover remielinização são significativos para a recuperação funcional após a lesão do nervo ^5. Assim, o objetivo deste protocolo é para ilustrar uma abordagem de engenharia que aborda estas duas questõesda regeneração do nervo.

Anisotropia de superfície, que é definido como a diferença, quando medida ao longo de eixos diferentes, nas propriedades físicas ou mecânicas de um material, tem sido aplicado para influenciar alinhamento de células, o crescimento, a migração e ^6-7. Além de topografia, existem outros métodos para induzir a anisotropia. Anteriormente, foi investigada anisotropia superfície induzida por processos mecânicos de pré-alongamento estático de poli-dimetil-siloxano (PDMS) de membrana. A teoria da "Super pequena deformação imposta em grande" previu que a rigidez efectiva das células sentir na direcção esticada difere da direcção perpendicular, e esta diferença de rigidez efectiva é devido à superfície de anisotropia ^8. As células estaminais mesenquimais (MSCs) cultivadas numa membrana pré-esticado PDMS são capazes de detectar a anisotropia puxando de forma activa à superfície e, como resultado, alinham na direcção pré-esticado ^9. Da mesma forma, uma superfície AR anisotrópicaisinger a partir de uma superfície pré-esticado mecânica afeta o alinhamento, assim como o crescimento e a mielinização do gânglio da raiz dorsal (DRG) axônios ^10. Aqui nós fornecemos um protocolo para a indução de anisotropia de superfície sobre um substrato pré-estirado estática PDMS para melhorar a regeneração do axônio ^10.

Para obter o alinhamento axônio, características topológicas com padrões desejados, relatou para fornecer orientação contato através de fibras e canais ^6,11-12 alinhados, foram demonstrados para facilitar o alinhamento axônio ^11,13. No entanto, relataram técnicas para induzir alinhamento axónio através características topológicas, tais como fibras, e canais de modelação, não foram capazes de prolongar e aumentar a espessura dos axónios. Em contraste, gradual estiramento mecânico levou ao alinhamento axónio na direcção do estiramento, com axónios compridas e espessas, que aumentaram com a magnitude do troço ^14. No entanto, com dispositivo de motor movido in vivo não éfactível. Em contraste, anisotropia induzida pré-esticado estática é menos complicado e pode ser mais facilmente incorporados em futuros desenhos de andaime para aplicações in vivo.

Neste protocolo, um sistema de cultura de células pré-esticado estático é usado para induzir a anisotropia superfície sem características topológicas. O sistema de cultura de pré-esticado é constituído por uma membrana de PDMS, um quadro esticável e uma etapa de alongamento, após o que a membrana é fixada sobre a armação e um troço magnitude predeterminada é aplicada sobre a fase de alongamento. neurónios DRG isoladas de fresco de cultura na superfície pré-esticado por até 21 dias são monitorados para o alinhamento axónio e espessura. Posteriormente, as células de Schwann (SCs) co-cultivadas com os axônios alinhados são monitorados para a mielinização. Ao incorporar pré-estiramento induzido anisotropia superfície fomos capazes de aumentar a célula Alinhamento de diferenciação e axônio Alinhamento de crescimento de MSCs e neurônios DRG ^9-10, respectivamente.

Protocol

Todos os procedimentos para o isolamento das células foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade Estadual de Michigan. 1. Preparação de pré-esticado superfície anisotrópica Misturar a 10: solução de base e um agente de cura e verter a mistura em um prato de cultura de tecidos (12 cm de diâmetro). Use 4,900 mg de base e 490 mg de agente de cura para a mistura total de reticulação. Manter a mistura de gel sob vácuo durante 20 min para remover as …

Representative Results

O sistema de cultura de células pré-esticado promovido DRG alinhamento 10 axónio. neurónios DRG foram cultivadas em superfícies pré-esticado e não estiradas durante 12 dias. Os axónios foram corados para β-III-tubulina para demonstrar o seu alinhamento. A Figura 2 compara a orientação axonal nas PDMS pré-esticado e não estiradas substratos após 12 dias de cultura. Os axónios DRG alinhados paralelamente à direcção esticada, enquanto que eles m…

Discussion

Para induzir o alinhamento axónio na superfície pré-esticado, existem dois passos essenciais: 1) a membrana PDMS tem de ser plana e de espessura homogénea; e 2) células gliais deve ser removido a partir do DRG. Depois de misturar os PDMS e agente de reticulação e cura em um forno, o gel PDMS reticulado deve ser mantido no topo de uma bancada plana e manuseadas com cuidado para evitar qualquer inclinação. O tratamento com plasma de oxigénio da membrana PDMS deve ser seguido dentro de 6 horas por revestimento de…

Materials

Polydimethylsiloxane （PDMS)	Dow Corning	SYLGARD 184
Neurobasal Medium 1X	GibcoBRL	21103-049
B27 Supplement 50X	GibcoBRL	17504-044
Glutamax-I 100X	GibcoBRL	35050-061
Albumax-I	GibcoBRL	11020-021
Nerve Growth Factor-7S	Invitrogen	13290-010
Penicillin-streptomycin	GibcoBRL	15140-122
0.05% Trypsin-EDTA/1mM EDTA	GibcoBRL	25300-054
Poly-L-Lysine	Trevigen	3438-100-01
Poly-D-Lysine	Sigma	p-6407
Fluoro-2 deoxy-uridine	Sigma	F0503
Uridine	Sigma	U3003
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Invitrogen	14170-112	Isolation Buffer
Type I Collagenase	Worthington	LS004196
DMEM	Gibco	11885
Heat inactivated Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30080.03
BPE	Clonetics	CC-4009
Forskolin	Calbiochem	344270
Silicone chamber	Greiner bio-one	FlexiPERM ConA
Plasma cleaning/etching system	March Instruments	PX-250
Anti-Thy 1.1 antibody	Sigma- Aldrich	M7898
Rabbit Complement	Sigma- Aldrich	S-7764
Standard growth medium			For 500 ml Neurobasal Medium 1X, add 10 ml of B-27 50X, 5 ml of Glutamax-I 100X,
			2.5 ml of Penicillin/Streptomycin (Penn/Strep), 1 ml of Albumax-I, and 1 μl of NGF– 7S (50 ug/ml).
FDU and Uridine stock solution			FDU 100mg in 10ml of ddw (10mg/ml), filter in the hood and divided in 500ul aliquots and store at -20 ºC.
			Uridine 5g in 166.7ml of ddw (33mg/ml), filter in hood, divide in 200ul aliquots and store at -20 ºC.
			Take 61.5ul of FDU (10mg/ml) and 20.5ul of Uridine(33mg/ml), and add 4918ul of ddw to a final stock concentration,
			then divide in 1 ml aliquots and store at -20 ºC.