Подход, чтобы усилить согласованность и миелинизации спинного ганглий корень Нейроны
Summary
This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.
Abstract
Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.
Introduction
В нервных травм, проксимальный и дистальный нервные пни часто предотвращается прямой перестройкой нервных пучках из – за повреждения участка 1-2. Обычно аксонов тракты состоят из упорядоченных и высоко выровненных пучков аксонов, которые образуют сложные сети связи. Тем не менее, регенерация нерва является хаотический процесс из – за плохо организованной выравнивании аксона 3-4. Таким образом, чтобы генерировать достаточное количество регенерирующей аксоны, позволяющего устранить месте повреждения, то необходимо, чтобы побудить хорошо организованной аксонов выравнивания. Кроме того, демиелинизация сопровождает повреждения нерва из-за гибели myelinating клеток в месте повреждения. Так как демиелинизация сильно ухудшает проводящую способность выдерживать аксоны, процедуры , направленные на демиелинизации или способствующие ремиелинизацию являются существенными для функционального восстановления после повреждения нерва 5. Таким образом, цель данного протокола, чтобы проиллюстрировать инженерный подход, учитывающий эти два вопросарегенерации нерва.
Поверхностная анизотропия, которая определяется как разница, при измерении вдоль различных осей, в физических или механических свойств материала , в, был применен влиять выравнивание клеток, рост и миграцию 6-7. В дополнение к топографии, существуют и другие методы, чтобы индуцирующие анизотропию. Ранее мы исследовали поверхностной анизотропии, вызванной механическим статическим предварительной протяжения поли-диметил-силоксановых (PDMS) мембраны. Теория "малой деформации супер , наложенных на большой" предсказал , что эффективная жесткость клетки чувствуют в растянутом направлении отличается от перпендикулярного направления, и эта разница в эффективной жесткости из – за поверхностной анизотропии 8. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) , культивируемые на предварительно растянутой мембраны PDMS способны чувствовать анизотропию, активно вытягивать поверхность , и в результате, выравнивать в предварительно растянутой направлении 9. Аналогичным образом, поверхность ар анизотропнаяизинговских от механического предварительно растянутой поверхности влияет на выравнивание, а также роста и миелинизации спинномозговых ганглиев (DRG) аксонов 10. Здесь мы приводим протокол для индукции поверхностной анизотропии на статическом предварительно растянутой подложке PDMS для повышения аксонов регенерации 10.
Для того, чтобы вызвать выравнивание аксонов, топологические особенности с заданными узорами, сообщает предоставить контактную руководство через выровненных волокон и каналов 6,11-12, были продемонстрированы для облегчения выравнивания аксонов 11,13. Тем не менее, сообщалось методы индукции выравнивания аксонов через топологических характеристик, таких как волокна, каналы и структурирование, были неспособны удлиняться и увеличить толщину аксонов. В противоположность этому , постепенное механическое растяжение привело к выравниванию аксонов в направлении растягивания с более длинными и более толстыми аксонами , которые увеличились с величиной перегоне 14. Тем не менее, включение устройства с независимым питанием двигателя в естественных условиях не являетсяпредставляется возможным. В противоположность этому , статическое предварительно растянутой наведенной анизотропии менее сложна и может быть более легко включены в будущие конструкции каркаса для применения в естественных условиях.
В этом протоколе, статический предварительно растянутой система клеточной культуры используется для индукции поверхностной анизотропии без топологических характеристик. Предварительно растянутая система культуры состоит из мембраны PDMS, поддающегося растягиванию рамой и простирающейся стадии, после чего мембрана закреплена на раме, а заданная величина растянуть применяется на стадии вытяжки. Свежевыделенные нейроны DRG культивировали на предварительно растянутой поверхности на срок до 21 дней, отслеживаются для выравнивания и толщины аксона. Впоследствии Шванн клетки (SCS) культивировали совместно с унифицированным аксонов контролируются на миелинизации. Объединив предварительно простирания индуцированной поверхностной анизотропии мы смогли улучшить ячейки выравнивания дифференциации и аксона выравнивания роста MSCs и DRG нейронов 9-10, соответственно.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для того, чтобы побудить аксонов выравнивание по предварительно растянутой поверхности, есть два важных шага: 1) мембрана PDMS должна быть ровной и гомогенной толщины; и 2) глиальные клетки должны быть удалены из DRG. После смешивания PDMS и сшивателя и отверждения в печи, сшитый гель PDMS должны…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Эрика Vasco за его помощь в подготовке субстратов PDMS, д-р Ван Shiyong в лаборатории доктора Марины Маты в Университете штата Мичиган за полезные советы и обучение изоляции DRG, и д-р Марк Tuszynski и д-р . В. Мари Кампана Калифорнийского университета в Сан-Диего за полезные предложения и протокол для изоляции SC. Это исследование было поддержано частично Национальным научным фондом (конбетить 0941055 и конбетить 1510895), Национальный институт здравоохранения (R21CA176854, R01GM089866 и R01EB014986).
Materials
| Polydimethylsiloxane （PDMS) | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
| Neurobasal Medium 1X | GibcoBRL | 21103-049 | |
| B27 Supplement 50X | GibcoBRL | 17504-044 | |
| Glutamax-I 100X | GibcoBRL | 35050-061 | |
| Albumax-I | GibcoBRL | 11020-021 | |
| Nerve Growth Factor-7S | Invitrogen | 13290-010 | |
| Penicillin-streptomycin | GibcoBRL | 15140-122 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA/1mM EDTA | GibcoBRL | 25300-054 | |
| Poly-L-Lysine | Trevigen | 3438-100-01 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | p-6407 | |
| Fluoro-2 deoxy-uridine | Sigma | F0503 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14170-112 | Isolation Buffer |
| Type I Collagenase | Worthington | LS004196 | |
| DMEM | Gibco | 11885 | |
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30080.03 | |
| BPE | Clonetics | CC-4009 | |
| Forskolin | Calbiochem | 344270 | |
| Silicone chamber | Greiner bio-one | FlexiPERM ConA | |
| Plasma cleaning/etching system | March Instruments | PX-250 | |
| Anti-Thy 1.1 antibody | Sigma- Aldrich | M7898 | |
| Rabbit Complement | Sigma- Aldrich | S-7764 | |
| Standard growth medium | For 500 ml Neurobasal Medium 1X, add 10 ml of B-27 50X, 5 ml of Glutamax-I 100X, | ||
| 2.5 ml of Penicillin/Streptomycin (Penn/Strep), 1 ml of Albumax-I, and 1 μl of NGF– 7S (50 ug/ml). | |||
| FDU and Uridine stock solution | FDU 100mg in 10ml of ddw (10mg/ml), filter in the hood and divided in 500ul aliquots and store at -20 ºC. | ||
| Uridine 5g in 166.7ml of ddw (33mg/ml), filter in hood, divide in 200ul aliquots and store at -20 ºC. | |||
| Take 61.5ul of FDU (10mg/ml) and 20.5ul of Uridine(33mg/ml), and add 4918ul of ddw to a final stock concentration, | |||
| then divide in 1 ml aliquots and store at -20 ºC. |
References
- Liu, C., et al. . Layer-by-Layer Films for Biomedical Applications. , 525-546 (2015).
- Faweett, J. W., Keynes, R. J. Peripheral Nerve Regeneration. Annu Rev Neurosci. 13, 43-60 (1990).
- Li, Y., Field, P. M., Raisman, G. Repair of adult rat corticospinal tract by transplants of olfactory ensheathing cells. Science. 277, 2000-2002 (1997).
- Geller, H. M., Fawcett, J. W. Building a bridge: Engineering spinal cord repair. Exp Neurol. 174, 125-136 (2002).
- Totoiu, M. O., Keirstead, H. S. Spinal cord injury is accompanied by chronic progressive demyelination. J Comp Neurol. 486, 373-383 (2005).
- Chua, J. S., et al. Extending neurites sense the depth of the underlying topography during neuronal differentiation and contact guidance. Biomaterials. 35, 7750-7761 (2014).
- Dowell-Mesfin, N. M., et al. Topographically modified surfaces affect orientation and growth of hippocampal neurons. J Neural Eng. 1, 78-90 (2004).
- Baek, S., Gleason, R. L., Rajagopal, K. R., Humphrey, J. D. Theory of small on large: Potential utility in computations of fluid-solid interactions in arteries. Comput Method Appl M. 196, 3070-3078 (2007).
- Liu, C., et al. Effect of Static Pre-stretch Induced Surface Anisotropy on Orientation of Mesenchymal Stem Cells. Cell Mol Bioeng. 7, 106-121 (2014).
- Liu, C., et al. The impact of pre-stretch induced surface anisotropy on axon regeneration. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
- Berns, E. J., et al. Aligned neurite outgrowth and directed cell migration in self-assembled monodomain gels. Biomaterials. 35, 185-195 (2014).
- Kidambi, S., Lee, I., Chan, C. Primary neuron/astrocyte co-culture on polyelectrolyte multilayer films: A template for studying astrocyte-mediated oxidative stress in neurons. Adv Funct Mater. 18, 294-301 (2008).
- Xia, H., et al. Directed neurite growth of rat dorsal root ganglion neurons and increased colocalization with Schwann cells on aligned poly(methyl methacrylate) electrospun nanofibers. Brain Research. 1565, 18-27 (2014).
- Smith, D. H. Stretch growth of integrated axon tracts: Extremes and exploitations. Prog Neurobiol. 89, 231-239 (2009).
- Mantuano, E., Jo, M., Gonias, S. L., Campana, W. M. Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein (LRP1) Regulates Rac1 and RhoA Reciprocally to Control Schwann Cell Adhesion and Migration. Journal of Biological Chemistry. 285, 14259-14266 (2010).
- Kim, B., ET, K. P., Papautsky, I. Long-term stability of plasma oxidized PDMS surfaces. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 7, 5013-5016 (2004).
- Lopera, S., Mansano, R. D. Plasma-Based Surface Modification of Polydimethylsiloxane for PDMS-PDMS Molding. ISRN Polymer Science. 2012, (2012).
- Chandra, G. . Organosilicon Materials. , (2013).
- Wu, M. H. Simple poly(dimethylsiloxane) surface modification to control cell adhesion. Surf Interface Anal. 41, 11-16 (2009).
- Moore, M. J., et al. Multiple-channel scaffolds to promote spinal cord axon regeneration. Biomaterials. 27, 419-429 (2006).
- Clarke, J. C., et al. Micropatterned methacrylate polymers direct spiral ganglion neurite and Schwann cell growth. Hearing Res. 278, 96-105 (2011).
- Pfister, B. J., et al. Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons. J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).
