Un Enfoque para Mejorar la alineación y la mielinización de las neuronas del ganglio de la raíz dorsal

Summary

This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.

Abstract

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.

Introduction

En las lesiones nerviosas, los muñones proximal y distal del nervio a menudo no pueden realineación directa de fascículos nerviosos debido a la zona de la lesión ^1-2. Normalmente, los tractos de axones se componen de haces altamente ordenados y alineados de los axones, que forman redes complejas de conectividad. Sin embargo, la regeneración nerviosa es un proceso caótico debido a la alineación del axón mal organizada ^3-4. Por lo tanto, para generar un número suficiente de regeneración de los axones que unen el sitio de la lesión, es necesario para inducir la alineación axonal bien organizado. Además, desmielinización acompaña a lesiones del nervio debido a la muerte de las células mielinizantes en el sitio de la lesión. Desde desmielinización deteriora fuertemente la capacidad conductora de sobrevivir a los axones, los tratamientos dirigidos desmielinización o promueven la remielinización son significativos para la recuperación funcional tras la lesión del nervio ^5. Así, el objetivo de este protocolo es ilustrar un enfoque de ingeniería que se ocupa de estas dos cuestionesde la regeneración nerviosa.

Anisotropía de superficie, que se define como la diferencia, cuando se mide a lo largo de diferentes ejes, en las propiedades físicas o mecánicas de un material, se ha aplicado a influir en la alineación celular, el crecimiento y la migración ^6-7. Además de la topografía, hay otros métodos para inducir anisotropía. Anteriormente, se investigó la anisotropía inducida por la superficie mecánica de pre-estiramiento estático de membrana de poli-dimetil-siloxano (PDMS). La teoría de la "pequeña súper deformación impuesta a gran" predijo que la rigidez efectiva de las células sentido en la dirección estirada difiere de la dirección perpendicular, y esta diferencia en la rigidez efectiva se debe a la anisotropía ⁸ la superficie. Las células madre mesenquimales (MSCs) cultivadas en una membrana de pre-estirado PDMS son capaces de detectar la anisotropía tirando activamente la superficie y, como resultado, alinear en la dirección de pre-estirado ^9. Del mismo modo, un ar superficie anisotrópicaising de una superficie pre-estirado mecánico afecta a la alineación, así como el crecimiento y la mielinización de ganglio de la raíz dorsal (DRG) axones ^10. Aquí proporcionamos un protocolo para la inducción de la anisotropía de superficie sobre un sustrato pre-estirado estática PDMS para mejorar la regeneración de axones ^10.

A fin de obtener la alineación del axón, características topológicas con patrones deseados, reportado por brindar orientación contacto a través de las fibras y los canales ^6,11-12 alineados, se demostró para facilitar la alineación axón ^11,13. Sin embargo, informó técnicas para la inducción de la alineación del axón a través de características topológicas, tales como fibras, los canales y los patrones, no fueron capaces de alargar y aumentar el grosor de los axones. Por el contrario, gradual estiramiento mecánico llevó a alineación axón en la dirección de estiramiento con axones más largos y más gruesos que el aumento de la magnitud del tramo ^14. Sin embargo, la incorporación de un dispositivo de motor alimentado in vivo no esfactible. En contraste, la anisotropía inducida por el pre-estirado estática es menos complicado y se puede incorporar más fácilmente en los futuros diseños de andamios para aplicaciones in vivo.

En este protocolo, un sistema de cultivo de células pre-estirado estático se utiliza para inducir anisotropía superficie sin características topológicas. El sistema de cultivo pre-estirado se compone de una membrana de PDMS, un marco estirable y una etapa de estiramiento, después de lo cual la membrana se fija sobre el marco y una magnitud tramo predeterminado se aplica en la etapa de estiramiento. recién aisladas DRG neuronas cultivadas en la superficie pre-estirado hasta por 21 días son monitoreados para la alineación del axón y grosor. Posteriormente, las células de Schwann (SC) co-cultivadas con los axones alineados están supervisados ​​por la mielinización. Mediante la incorporación inducida de pre-estirado anisotropía superficie hemos sido capaces de mejorar la alineación de células-diferenciación y axón alineación-crecimiento de MSCs y las neuronas DRG ^9-10, respectivamente.

Protocol

Todos los procedimientos para el aislamiento de las células fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad del Estado de Michigan. 1. Preparación de pre-estirado superficial anisotrópico Mezclar un 10: 1 solución de base y agente de curado y se vierte la mezcla en una placa de cultivo tisular (12 cm de diámetro). Utilice 4,900 mg de base y 490 mg de agente de curado de la mezcla total de reticulación. Mantener la mezcla de gel a vacío dura…

Representative Results

El sistema de cultivo celular pre-estirada promovido DRG alineación axón 10. DRG neuronas se cultivaron sobre superficies pre-estiradas y sin estirar durante 12 días. Los axones fueron teñidos para β-III-tubulina para demostrar su alineación. La Figura 2 compara la orientación axón en el PDMS pre-estirados y sin estirar sustratos después de 12 días de cultivo. Los axones DRG alineados paralelamente a la dirección de estirado, mientras que mostraron …

Discussion

Para inducir la alineación axón en la superficie pre-estirado, hay dos pasos críticos: 1) la membrana de PDMS debe ser plana y de un espesor homogéneo; y 2) las células gliales se deben retirar de la DRG. Después de mezclar el PDMS y agente de reticulación y curado en un horno, el gel reticulado PDMS debe mantenerse en la cima de banco plano y manejarla con cuidado para evitar cualquier inclinación. El tratamiento con plasma de oxígeno de la membrana de PDMS se debe seguir dentro de 6 h por recubrimiento de PLL…

Materials

Polydimethylsiloxane （PDMS)	Dow Corning	SYLGARD 184
Neurobasal Medium 1X	GibcoBRL	21103-049
B27 Supplement 50X	GibcoBRL	17504-044
Glutamax-I 100X	GibcoBRL	35050-061
Albumax-I	GibcoBRL	11020-021
Nerve Growth Factor-7S	Invitrogen	13290-010
Penicillin-streptomycin	GibcoBRL	15140-122
0.05% Trypsin-EDTA/1mM EDTA	GibcoBRL	25300-054
Poly-L-Lysine	Trevigen	3438-100-01
Poly-D-Lysine	Sigma	p-6407
Fluoro-2 deoxy-uridine	Sigma	F0503
Uridine	Sigma	U3003
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Invitrogen	14170-112	Isolation Buffer
Type I Collagenase	Worthington	LS004196
DMEM	Gibco	11885
Heat inactivated Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30080.03
BPE	Clonetics	CC-4009
Forskolin	Calbiochem	344270
Silicone chamber	Greiner bio-one	FlexiPERM ConA
Plasma cleaning/etching system	March Instruments	PX-250
Anti-Thy 1.1 antibody	Sigma- Aldrich	M7898
Rabbit Complement	Sigma- Aldrich	S-7764
Standard growth medium			For 500 ml Neurobasal Medium 1X, add 10 ml of B-27 50X, 5 ml of Glutamax-I 100X,
			2.5 ml of Penicillin/Streptomycin (Penn/Strep), 1 ml of Albumax-I, and 1 μl of NGF– 7S (50 ug/ml).
FDU and Uridine stock solution			FDU 100mg in 10ml of ddw (10mg/ml), filter in the hood and divided in 500ul aliquots and store at -20 ºC.
			Uridine 5g in 166.7ml of ddw (33mg/ml), filter in hood, divide in 200ul aliquots and store at -20 ºC.
			Take 61.5ul of FDU (10mg/ml) and 20.5ul of Uridine(33mg/ml), and add 4918ul of ddw to a final stock concentration,
			then divide in 1 ml aliquots and store at -20 ºC.