En strategi för att öka Justering och myelinisering av Dorsal Root ganglieneuroner

Summary

This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.

Abstract

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.

Introduction

I nervskador, är de proximala och distala nervstumparna ofta hindras från direkt omläggning av nerv fascicles på grund av skadestället ^1-2. Normalt axon områden består av mycket ordnade och inriktade buntar av axoner, som bildar komplexa nätverk av anslutningsmöjligheter. Men är nervregeneration en kaotisk process på grund av dåligt organiserade Axon inriktning ^3-4. Därför, för att generera ett tillräckligt antal regenererande axoner som överbryggar lesionsstället, är det nödvändigt att inducera välorganiserad axonal inriktning. Dessutom medföljer demyelinisering nervskador till döds av myeliniserande celler vid skadestället. Eftersom demyelinisering försämrar starkt ledande förmåga att överleva axoner, behandlingar inriktade demyelinisering eller främjar remyelinisering har betydelse för funktionell återhämtning efter nervskada ^5. Således Målet med detta protokoll är att illustrera ett ingenjörsmässigt förhållningssätt som tar upp dessa två frågorav nervregeneration.

Yta anisotropi, vilken definieras som en skillnad, vid mätning längs olika axlar, i ett materials fysikaliska eller mekaniska egenskaper, har tillämpats för att påverka celljustering, tillväxt och migration ^6-7. Förutom topografi, det finns andra metoder att inducera anisotropi. Tidigare undersökte vi yta anisotropi induceras genom mekanisk statisk försträck av poly-dimetyl-siloxan (PDMS) membran. Teorin om "små deformation super införts på stora" förutspådde att den effektiva styvheten cellerna avkänner i sträckt riktning skiljer sig från den vinkelräta riktningen, och denna skillnad i effektiv styvhet beror på att ytan anisotropi ^8. Mesenkymala stamceller (MSC) odlade på ett i förväg sträckt PDMS membranet har möjlighet att känna av anisotropin genom att aktivt dra ytan och som ett resultat, rikta in den försträckta riktning ^9. På liknande sätt, en anisotrop yta arising ur mekanisk försträckt ytan påverkar justering, samt tillväxt och myelinering av dorsala rotganglier (DRG) axoner ^10. Här ger vi ett protokoll för att framkalla yta anisotropi på en statisk försträckt PDMS substrat för att förbättra Axon förnyelse ^10.

Att framkalla axon inriktning, topologiska funktioner med önskade mönster, rapporterade att ge kontakt vägledning genom inriktade fibrer och kanaler ^6,11-12, visades att underlätta Axon inriktning ^11,13. Rapporterade dock tekniker för att inducera Axon anpassning genom topologiska funktioner, såsom fibrer, kanaler och mönstring, kunde inte förlänga och öka tjockleken av axoner. Däremot gradvis mekanisk sträckning lett till Axon inriktning i sträckningsriktningen med längre och tjockare axoner som ökade med storleken på sträckan ^14. Att införliva en driven motor enhet in vivo är intemöjlig. I motsats härtill är statisk försträckt inducerad anisotropi mindre komplicerat och lättare kan införlivas i framtida ställnings designer för tillämpningar in vivo.

I detta protokoll, är en statisk försträckt cellodlingssystem som används för att framkalla yta anisotropi utan topologiska funktioner. Den försträckta odlingssystemet är sammansatt av en PDMS-membran, en töjbar ram och en sträckningssteget, varefter membranet är fäst på ramen och en förutbestämd sträcka magnitud anbringas på sträckningssteget. Nyligen isolerade DRG nervceller odlade på den försträckta yta för upp till 21 dagar övervakas för axon inriktning och tjocklek. Därefter Schwann-celler (SCS) samodlas med de inriktade axoner övervakas för myelinisering. Genom att införliva försträck inducerad yta anisotropi kunde vi öka celljustering-differentiering och axon justerings tillväxten av MSC och DRG nervceller ^9-10, respektive.

Protocol

Alla förfaranden för isolering av cellerna godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid Michigan State University. 1. Framställning av försträckt Anisotrop Surface Blanda en 10: 1 lösning av bas och härdare och häll blandningen i en vävnadsodlingsskål (12 cm diameter). Använda 4900 mg bas och 490 mg härdningsmedel för det totala tvärbindningsblandningen. Hålla gelblandningen under vakuum i 20 minuter för att avlägsna luftbubblor. Placera ge…

Representative Results

Den försträckta cellodlingssystem främjas DRG axon anpassningen 10. DRG nervceller odlades på försträckt och osträckta ytor för 12 dagar. Axoner färgades för β-III-tubulin att visa sin inriktning. Figur 2 jämför axon orientering på försträckt och osträckta PDMS substrat efter 12 dagars odling. DRG axoner inriktade parallellt med den sträckta riktningen, medan de visade slumpmässig inriktning och bildade ett sammanhängande nätverk på den o…

Discussion

För att inducera axon anpassningen försträckt yta, det finns två viktiga steg: 1) PDMS membranet måste vara plan och homogen tjocklek; och 2) gliaceller måste avlägsnas från DRG. Efter blandning av PDMS och tvärbindningsmedel och härdning i en ugn, ska den tvärbundna PDMS gel hållas på en plan bänk och hanteras varsamt för att undvika tippning. Syreplasmabehandling av PDMS membranet bör följas inom 6 tim med PLL-beläggning, eftersom hydrofiliciteten hos ytan (krävs för cellbindning) efter plasmabehan…

Materials

Polydimethylsiloxane （PDMS)	Dow Corning	SYLGARD 184
Neurobasal Medium 1X	GibcoBRL	21103-049
B27 Supplement 50X	GibcoBRL	17504-044
Glutamax-I 100X	GibcoBRL	35050-061
Albumax-I	GibcoBRL	11020-021
Nerve Growth Factor-7S	Invitrogen	13290-010
Penicillin-streptomycin	GibcoBRL	15140-122
0.05% Trypsin-EDTA/1mM EDTA	GibcoBRL	25300-054
Poly-L-Lysine	Trevigen	3438-100-01
Poly-D-Lysine	Sigma	p-6407
Fluoro-2 deoxy-uridine	Sigma	F0503
Uridine	Sigma	U3003
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Invitrogen	14170-112	Isolation Buffer
Type I Collagenase	Worthington	LS004196
DMEM	Gibco	11885
Heat inactivated Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30080.03
BPE	Clonetics	CC-4009
Forskolin	Calbiochem	344270
Silicone chamber	Greiner bio-one	FlexiPERM ConA
Plasma cleaning/etching system	March Instruments	PX-250
Anti-Thy 1.1 antibody	Sigma- Aldrich	M7898
Rabbit Complement	Sigma- Aldrich	S-7764
Standard growth medium			For 500 ml Neurobasal Medium 1X, add 10 ml of B-27 50X, 5 ml of Glutamax-I 100X,
			2.5 ml of Penicillin/Streptomycin (Penn/Strep), 1 ml of Albumax-I, and 1 μl of NGF– 7S (50 ug/ml).
FDU and Uridine stock solution			FDU 100mg in 10ml of ddw (10mg/ml), filter in the hood and divided in 500ul aliquots and store at -20 ºC.
			Uridine 5g in 166.7ml of ddw (33mg/ml), filter in hood, divide in 200ul aliquots and store at -20 ºC.
			Take 61.5ul of FDU (10mg/ml) and 20.5ul of Uridine(33mg/ml), and add 4918ul of ddw to a final stock concentration,
			then divide in 1 ml aliquots and store at -20 ºC.