Borttagning av exogena material från den yttre delen av frysta kärnor för att undersöka forntida biologiska samhällen hyste Inside
Summary
Kryosfären ger dig tillgång till bevarade organismer som pågått under tidigare miljöförhållanden. Ett protokoll presenteras för att samla in och sanera permafrost kärnor av jordar och is. Frånvaron av exogena kolonier och DNA tyder på att mikroorganismer detekteras representerar materialet, snarare än förorening från borrning eller bearbetning.
Abstract
The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect conditions over vast time periods and investigation of biological materials harbored inside could provide insight of ancient environments. To appropriately analyze these ecosystems and extract meaningful biological information from frozen soils and ice, proper collection and processing of the frozen samples is necessary. This is especially critical for microbial and DNA analyses since the communities present may be so uniquely different from modern ones. Here, a protocol is presented to successfully collect and decontaminate frozen cores. Both the absence of the colonies used to dope the outer surface and exogenous DNA suggest that we successfully decontaminated the frozen cores and that the microorganisms detected were from the material, rather than contamination from drilling or processing the cores.
Introduction
Kryosfären (t.ex. permafrost jordar, is funktioner, glacial snö, Firn och is) ger en inblick i vilka typer av organismer kvarstod under tidigare miljöförhållanden. Eftersom dessa substrat kan vara tiotals till hundratals tusentals år gamla, deras mikrobiella samhällen, när bevarade frysta sedan deponering, speglar gamla miljöförhållanden. Att på lämpligt sätt analysera dessa ekosystem och extrahera meningsfull biologisk information från frysta jordar och is, korrekt insamling och bearbetning av de frysta proverna är nödvändigt. Detta är av yttersta vikt eftersom klimatprognoser för det 21: a århundradet indikerar potential för en uttalad uppvärmning i arktiska och subarktiska områden 1. Specifikt, Inre Alaska och Grönland förväntas värma cirka 5 ° C och 7 ° C, respektive år 2100 2,3. Detta förväntas avsevärt påverka mark och vatten mikrobiella samhällen, och därför tillhörandebiogeokemiska processer. De varmare temperaturer och förändrad nederbörd regimen förväntas initiera permafrost nedbrytning i många områden 2-5 vilket kan leda till en tjockare, säsongs tinas (aktiv) skikt 6,7, upptining av frysta jordar, och smältning av massiva is organ såsom marken is, is kilar, och segregation is 8. Detta skulle dramatiskt förändra de biogeokemiska attribut utöver den biologiska mångfalden av växter och djur i dessa ekosystem.
Glaciäris och syngenetic permafrost sediment och is funktioner har fastnat kemiska och biologiska bevis för en miljö som representerar vad bodde där vid tidpunkten funktioner bildas. Till exempel i Inre Alaska, både Illinoisan och Wisconsin åldern permafrost är närvarande och detta permafrost i synnerhet ger unika platser anor från modern till 150.000 år före nutid (YBP) som innehåller biologiska och geokemiska bevis på ImpaCT av tidigare klimatförändringar på biologisk mångfald. Som ett resultat av dessa sediment ge en dokumentation av biogeokemi och biologisk mångfald under många tusen år. Eftersom området har låga sedimenteringshastigheter och har aldrig varit istäckt, ostörda prover är tillgängliga för insamling och analys, antingen borrning vertikalt i jordprofilen eller borrning horisontellt i tunnlar. Ännu viktigare, finns omfattande register som särskilt lyfta fram de unika biogeokemiska funktioner i permafrost i denna region 9-14. Specifikt tillämpningen av DNA-analys uppskatta förekomsten och omfattningen av den biologiska mångfalden i både existerande och gamla isen och permafrostprover möjliggör utforskning av kopplingen av gamla miljöförhållanden och livsmiljö för ockupation av specifika organismer.
Tidigare studier har identifierat klimatpåverkan på däggdjur, växter och mikroorganismer från prover som går till 50k YBP 11, 15-19, men varje studie använde en different metod för att samla in och sanera de permafrost eller iskärnor. I vissa fall har borrkärnorna steriliseras 16, 20-21, även om särskild metod inte klargöra om utländska nukleinsyror också eliminerades från proverna. I andra studier, isolerar bakterier 15 (t.ex. Serratia marcescens) samt fluorescerande mikrosfärer 22 har använts för att mäta effekten av saneringsförfaranden.
Detta experiment var en del av en större studie som undersökte mikrobiella samhällen från permafrost prover som går tillbaka till ca 40k YBP. Det särskilda syftet med denna del av studien var att framgångsrikt sanera is och permafrost kärnor. Såvitt vi vet har ingen metod integrerat användningen av lösningar som är utformade för att eliminera främmande nukleinsyror och associerade nukleaser från den yttre delen av de frysta kärnor. Detta trots det faktum att dessa lösningar är commonly används för att sanera laboratorieutrustning för molekylär experiment.
När kärnorna dekontamineras, extraherades genomiskt DNA med användning av de protokoll som utvecklats av Griffiths et al. 23 och et al. Towe 24, kvantifieras med hjälp av en spektrofotometer, och utspäddes med sterilt, DNA-fritt vatten för att uppnå 20 ng per reaktion. Bakteriella 16S rRNA gener förstärktes med primer 331F och 797R och sond BacTaq 25 och archaeal 16S rRNA gener förstärktes med primers Arch 349F och Arch 806R och prob TM Arch 516F 26 på följande villkor: 95 ° C under 600 sekunder följt av 45 cykler av 95 ° C under 30 sekunder, 57 ° C under 60 sek, och 72 ° C under 25 sek med slutlig förlängning vid 40 ° C under 30 sek. Alla qPCR Reaktionerna utfördes i duplikat. De 20 | il reaktionsvolymer ingår 20 ng DNA, 10 | iM av primers, 5 uM av sonden, och 10 | il av den qPCR-reaktionsblandningen. standarder for bakterier och archaeal qPCR framställdes med användning iskt DNA från Pseudomonas fluorescens och Halobacterium salinarum, respektive. Båda odlades till logfas. Platträkningar utfördes och DNA isolerades från kulturerna. Genomiskt DNA kvantifierades med en spektrofotometer med antagandet av en och sex kopior av 16S rRNA-genen per genomet för H. salinarum och P. fluorescens, respektive 27-28. Antalet kopior av den bakteriella och archaeal gener beräknades baserat på standardkurvan, log-transformerade att redogöra för ojämlika skillnader mellan behandlingarna, och bedömas av ANOVA.
Gemenskap sammansättning bestämdes genom sekvensering av 16S rRNA-genen med hjälp av flödesceller och bro teknik för förstärkning och analys av de samhällen med "kvantitativa insikter mikrobiell ekologi" (QIIME) 29. Framåt och bakåt läser förenades tillsammans och sedan sekvenser filtrerades, indexeras,och företrädare på hög kvalitet valdes för de novo operativa taxonomiska enheter (OTU) uppdrag genom sekvensinpassning med en referensdatabas. Inpassade sekvenser jämfördes med en separat referensdatabas för taxonomisk uppdrag. En fylum nivå OTU tabellen skapades för att bestämma allmän gemenskap sammansättning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kryosfären ger dig tillgång till bevarade organismer som pågått under tidigare miljöförhållanden. Även den återvunna taxa inte kan representera hela historiska samhället, kan de återhämtat sig från analys av glaciäris och permafrost prover ge värdefull historisk information om utvalda tidsperioder 15-16. Till exempel har meningsfull biologisk information tagits från isen studier som undersöker anaerob aktivitet i Grönlands istäcke 20 och permafrost studier som undersöker kolets …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded through the U.S. Army Engineer Research and Development Center, Basic Research Program Office. Permission for publishing this information has been granted by the Chief of Engineers.
Materials
| Auger | Snow, Ice, and Permafrost Research Establishment (SIPRE), Fairbanks, AK | N/A | |
| 70% Isopropanol | Walmart | 551116880 | |
| 95% Ethyl Alcohol (denatured) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | A407-4 | |
| DNA decontamination solution, DNA Away | Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA | 7010 | |
| RNase decontamination solution, RNase Away | Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA | 7002 | |
| Light Duty Suits | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 10606 | |
| Nitrile Gloves | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | FFS-700 | |
| Antiviral Masks | Curad, Walgreens | CUR3845 | |
| Sterile Sample Bags | Nasco, Fort Atkinson, WI | B01445 | |
| Steel Microtome Blade | B-Sharp Microknife, Wake Forest, NC | N/A | |
| Metal Rack | Fabricated at CRREL, Hanover, NH | N/A | |
| Tray | Handy Paint Products, Chanhassen, MN | 7500-CC | |
| Aluminum Foil | Western Plastics, Temecula, CA | N/A | |
| 500 ml Bottle with 0.22 μm Filter | Corning, Corning, NY | 430513 | |
| Serratia marcescens | ATCC, Manassas, VA | 17991 | |
| Biosafety Hood | NuAire, Plymouth, MN | NU-425-400 | |
| Petri Dish | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | FB0875712 | |
| ATCC Agar 181- Tryptone | Acros Organics, NJ | 61184-5000 | |
| ATCC Agar 181- Glucose | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP381-500 | |
| ATCC Agar 181- Yeast Extract | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP1422-500 | |
| ATCC Agar 181- Dipotassium Phosphate | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3252-01 | |
| ATCC Agar 181- Agar | Difco, Sparks, MD | 214530 | |
| NanoDrop 2000 UV Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE | ||
| Lightcycler 480 System | Roche Molecular Systems, Inc., Indianapolis, IN | ||
| Halobacterium salinarum | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ||
| Pseudomonas fluorescens | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ||
| Microbial DNA Isolation Kit | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 12224-50 | |
| Ear Protection | Elvex | EP-201 | |
| Hard Hat | N/A | N/A | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 34705 | |
| Glass Wool | Pyrex | 430330 | |
| Ruler | N/A | N/A | |
| Weighing Tin | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 08-732-100 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich, St Louis, MO | S-9625 | |
| Potassium chloride | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3040-04 | |
| Potassium phosphate, monobasic | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3246-01 | |
| Potassium phosphate, dibasic | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3252-01 | |
| Sodium phosphate dibasic, anhydrous | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP332-500 | |
| 50 ml Centrifuge Tubes | Corning, Corning, NY | 4558 | |
| 2 ml Microcentrifuge Tubes | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 1200-250-T | |
| 2 ml Ceramic Bead Tubes (1.4 mm) | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 13113-50 | |
| Scoopula | Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE | 1437520 | |
| Balance | Ohaus, Parsippany, NJ | E12130 | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich, St Louis, MO | D5758 | |
| Hexadecyltrimethylammoniabromide (CTAB) | Acros Organics, NJ | 22716-5000 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Sigma Aldrich, St Louis, MO | P5413-1KG | |
| Phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1) (pH 8) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP1752-400 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | 5417R | |
| Chloroform-isoamyl alcohol (24:1) | Sigma Aldrich, St Louis, MO | C0549-1PT | |
| TE Buffer | Ambion (Thermo Fisher), Wilmington, DE | AM9860 | |
| Pipets | Rainin, Woburn, MA | Pipet Lite XLS, 2, 10, 200, 1nd 1000ul pipets | |
| Pipet tips | Rainin, Woburn, MA | Rainin LTS presterilized, low retention, filtered tips, 10, 20, 200, 1000ul | |
| Vortexor | Scientific Industries, Bohemia, NY | G-560 | |
| Vortex Adaptor | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 13000-V1 | |
| Clear Bottle | Corning, Corning, NY | C1395500 | |
| Amber Bottle | Corning, Corning, NY | C5135250 | |
| Bottle Top Filters, 0.22um | Corning, Corning, NY | 430513 | |
| 60 mL Syringe | Becton, Dickenson and Company, Franklin Lakes, NJ | BD 309653 | |
| Millex Syringe filters, 0.22 μm | EMD Millipore, Billerica, MA | SLGV033RB | |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP2818-500 | diluted & filter sterilized |
| Isotemp 100 L Oven | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 151030511 | |
| Cell Spreader | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 08-100-10 | |
| Disposable Inoculating Loops | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 22-363-602 |
References
- Solomon, S., et al. . Climate Change 2007: The Physical Science Basis. , (2007).
- Marchenko, S., Romanovsky, V., Tipenko, G. Numerical Modeling of Spatial Permafrost Dynamics in Alaska. Proc. Ninth Int. Conferen. Permafr. 29, 1125-1130 (2008).
- Pachauri, R. K., Meyer, L. A. . Climate Change 2014: Synthesis Report. Contributions of Working Groups I, II, and III to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. , (2007).
- Osterkamp, T. E., Romanovsky, V. E. Evidence for warming and thawing of discontinuous permafrost in Alaska. Permafr. Periglac. Process. 10 (1), 17-37 (1999).
- Wolken, J. M., et al. Evidence and implications of recent and projected climate change in Alaska’s forest ecosystems. Ecosphere. 2 (11), 1-35 (2011).
- Hinzman, L. D., Kane, D. L., Gieck, R. E., Everett, K. R. Hydrologic and thermal properties of the active layer in the Alaskan Arctic. Cold Reg. Sci. Technol. 19 (2), 95-110 (1991).
- Hinzman, L. D., Goering, D. J., Kane, D. L. A distributed thermal model for calculating temperature profiles and depth of thaw in permafrost regions. J. Geophys. Res.: Atmos. 103 (D22), 28975-28991 (1998).
- Osterkamp, T. E., Jorgenson, J. C. Warming of Permafrost in the Arctic National Wildlife Refuge. Alaska. Permafr. Periglac. Process. 17, 65-69 (2006).
- Petrone, K. C., Jones, J. B., Hinzman, L. D., Boone, R. D. Seasonal export of carbon, nitrogen, and major solutes from Alaskan catchments with discontinuous permafrost. J. Geophys. Res. 111, G02020 (2006).
- Guo, L., Ping, C. -. L., Macdonald, R. W. Mobilization pathways of organic carbon from permafrost to arctic rivers in a changing climate. Geophys. Res. Lett. 34 (13), L13603 (2007).
- Katayama, T., et al. Phylogenetic analysis of bacteria preserved in a permafrost ice wedge for 25,000 years. Appl. Environ. Microbiol. 73 (7), 2360-2363 (2007).
- Katayama, T., et al. Glaciibacter superstes gen. nov., sp. nov., a novel member of the family Microbacteriaceae isolated from a permafrost ice wedge. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 59, 482-486 (2009).
- Waldrop, M. P., White, R., Douglas, T. A. Isolation and identification of cold-adapted fungi in the Fox Permafrost Tunnel, Alaska. Proc. Ninth Int. Conferen. Permafr. , 1887-1891 (2008).
- Douglas, T. A., et al. Biogeochemical and geocryological characteristics of wedge and thermokarst-cave ice in the CRREL Permafrost Tunnel. Alaska Permafr. Periglac. Process. 21 (2), 120-128 (2011).
- Willerslev, E., et al. Diverse plant and animal genetic records from Holocene and Pleistocene sediments. Science. 300 (5620), 791-795 (2003).
- Bellemain, E., et al. Fungal palaeodiversity revealed using high-throughput metabarcoding of ancient DNA from Arctic permafrost. Environ. Microbiol. 15 (4), 1176-1189 (2013).
- Steven, B., Pollard, W. H., Greer, C. W., Whyte, L. G. Microbial diversity and activity through a permafrost/ground ice core profile from the Canadian high Arctic. Environ. Microbiol. 10 (12), 3388-3403 (2008).
- Lorenzen, E. D., et al. Species-specific responses of Late Quaternary megafauna to climate and humans. Nature. 479 (7373), 359-364 (2011).
- Wilhelm, R. C., Radtke, K., Mykytczuk, N. C. S., Greer, C. W., Whyte, L. G. Life at the wedge: The activity and diversity of Arctic ice wedge microbial communities. Astrobiol. 12 (4), 347-360 (2012).
- Sheriden, P. P., Miteva, V. I., Brenchley, J. E. Phylogenetic analysis of anaerobic psychrophilic enrichment cultures obtained from a Greenland glacier ice core. Appl. Environ. Microbiol. 69 (4), 2153-2160 (2003).
- Rivkina, E., et al. Biogeochemistry of methane and methanogenic archaea in permafrost. FEMS Microbiol. Ecol. 61 (1), 1-15 (2007).
- Juck, D. F., et al. Utilization of fluorescent microspheres and a green fluorescent protein-marked strain for assessment of microbiological contamination of permafrost and ground ice core samples from the Canadian High Arctic. Appl. Environ. Microbiol. 71 (2), 1035-1041 (2005).
- Griffiths, R. I., Whiteley, A. S., O’Donnell, A. G., Bailey, M. J. Rapid method for coextraction of DNA and RNA from natural environments for analysis of ribosomal DNA- and rRNA-based microbial community composition. Appl. Environ. Microbiol. 66 (12), 5488-5491 (2000).
- Töwe, S., et al. Improved protocol for the simultaneous extraction and column-based separation of DNA and RNA from different soils. J. Microbiol. Methods. 84 (3), 406-412 (2011).
- Nadkarni, M. A., Martin, F. E., Jacques, N. A., Hunter, N. Determination of bacterial load by real-time PCR using a broad range (universal) probe and primers set. Microbiol. 148, 257-266 (2002).
- Takai, K., Horikoshi, K. Rapid detection and quantification of members of the archaeal community by quantitative PCR using fluorogenic probes. Appl. Environ. Microbiol. 66 (11), 5066-5072 (2000).
- Fogel, G. B., Collins, C. R., Brunk, C. F. Prokaryotic genome size and SSU rDNA copy number: Estimation of microbial relative abundance from a mixed population. Microb. Ecol. 38, 93-113 (1999).
- Bodilis, J., Nsigue-Meilo, S., Besaury, L., Quillet, L. Variable copy number, intra-genomic heterogeneities and later transfers of the 16S rRNA gene in Pseudomonas. PLOS One. 7, e35647 (2012).
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
- Sellmann, P. V. . Geology of the USA CRREL permafrost tunnel, Fairbanks, Alaska. US Army Cold Reg. Res. Eng. Lab. Technical Rep. 199. , (1967).
- Sellmann, P. V. . Additional information on the geology and properties of materials exposed in the USA CRREL permafrost tunnel. US Army CRREL Special Rep. , (1972).
- Christner, B. C., Mikucki, J. A., Foreman, C. M., Denson, J., Priscu, J. C. Glacial ice cores: A model system for developing extraterrestrial decontamination protocols. Icarus. 174 (2), 572-584 (2005).
- Mackelprang, R., et al. Metagenomic analysis of a permafrost microbial community reveals a rapid response to thaw. Nature. 480 (7377), 368-371 (2011).
- Champlot, S., et al. An efficient multistrategy DNA decontamination of PCR reagents for hyper sensitive PCR applications. PLoS One. 5 (9), e13042 (2010).
- Yergeau, E., Hogues, H., Whyte, L. G., Greer, C. W. The functional potential of high Arctic permafrost revealed by metagenomic sequencing, qPCR, and microarray analyses. The ISME J. 4 (9), 1206-1214 (2010).
- Welzl, G., Schloter, M. Bacterial community structure in soils of the Tibetan Plateau affected by discontinuous permafrost or seasonal freezing. Biol. Fertil. Soils. 50 (3), 555-559 (2014).
- Vishnivetskaya, T. A., et al. Commercial DNA extraction kits impact observed microbial community composition in permafrost samples. FEMS Microbiol. Ecol. 87 (1), 217-230 (2014).
- Wagner, D., Kobabe, S., Liebner, S. Bacterial community structure and carbon turnover in permafrost-affected soils of the Lena Delta, northeastern Siberia. Can. J. Microbiol. 55 (1), 73-83 (2009).
- Jiang, N., et al. Characteristic microbial communities in the continuous permafrost beside the bitumen in Qinghai-Tibetan Plateau. Environ. Earth Sci. 74, 1343-1352 (2015).
