Remoção de materiais exógenos da parte exterior dos núcleos congelados para investigar a antiga comunidades biológicas abrigava Dentro

Summary

A criosfera oferece acesso a organismos preservados que persistiram sob condições ambientais do passado. Um protocolo é apresentada para recolher e descontaminar núcleos permafrost de solos e gelo. A ausência de colónias exógenas e DNA sugerem que os microrganismos detectados representam o material, em vez de contaminação de perfuração ou de processamento.

Abstract

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect conditions over vast time periods and investigation of biological materials harbored inside could provide insight of ancient environments. To appropriately analyze these ecosystems and extract meaningful biological information from frozen soils and ice, proper collection and processing of the frozen samples is necessary. This is especially critical for microbial and DNA analyses since the communities present may be so uniquely different from modern ones. Here, a protocol is presented to successfully collect and decontaminate frozen cores. Both the absence of the colonies used to dope the outer surface and exogenous DNA suggest that we successfully decontaminated the frozen cores and that the microorganisms detected were from the material, rather than contamination from drilling or processing the cores.

Introduction

A criosfera (por exemplo, solos de permafrost, características gelo, neve glacial, firn e gelo) oferece um vislumbre do que tipos de organismos persistiu em condições ambientais do passado. Uma vez que estes substratos pode ser dezenas a centenas de milhares de anos de idade, suas comunidades microbianas, quando preservado congeladas desde a deposição, refletem as condições ambientais antigos. Para analisar adequadamente estes ecossistemas e extrair informação biológica significativa de solos congelados e gelo, coleta adequada e processamento das amostras congeladas é necessário. Isto é de extrema importância como projeções climáticas ^para o século 21 indicam o potencial para um aquecimento acentuado em regiões árticas e sub-árticas ^1. Especificamente, Interior do Alasca e Groenlândia são esperados para aquecer cerca de 5 ° C e 7 ° C, respectivamente em 2100 ^2,3. Isto é esperado para afetar significativamente o solo e comunidades microbianas aquáticos, e, portanto, relacionadaprocessos biogeoquímicos. As temperaturas mais quentes e regime de precipitação alterados são esperados para iniciar a degradação do permafrost em muitas áreas ^2-5 potencialmente levando a uma mais grossa, sazonalmente descongelado (ativo) camada ^6,7, o degelo dos solos congelados, ea fusão de corpos de gelo enormes, tais como gelo no solo, cunhas de gelo, e segregação de gelo ^8. Isto mudaria drasticamente os atributos biogeoquímicos além da biodiversidade de plantas e animais nestes ecossistemas.

gelo glacial e características de sedimentos permafrost e gelo singenéticos ter aprisionado química e evidência biológica de um ambiente representando o que viveu lá no momento as características formado. Por exemplo, no Interior do Alasca, tanto Illinoisan e Wisconsin permafrost com idades estão presentes e este permafrost em particular fornece os locais únicos que datam de moderno a 150.000 anos antes do presente (YBP) que contêm evidência biológica e geoquímica do impact das mudanças climáticas passadas sobre a biodiversidade. Como resultado, estes sedimentos fornecem um registro da biogeoquímica e da biodiversidade ao longo de muitos milhares de anos. Uma vez que a área tem taxas de sedimentação baixos e nunca foi glaciar, as amostras não perturbadas são acessíveis para recolha e análise, tanto de perfuração verticalmente no perfil do solo ou de perfuração horizontal em túneis. Mais importante ainda, existem extensos registros que, especialmente destacar as características únicas de biogeoquímicos permafrost nessa região ^9-14. Especificamente, a aplicação da análise de DNA para estimar presença e extensão da biodiversidade em ambas as amostras de gelo e permafrost existentes e antigas permite a exploração da ligação das condições ambientais antigas e habitat para a ocupação por organismos específicos.

Estudos anteriores identificaram impactos climáticos sobre mamíferos, plantas e microorganismos de amostras datando de 50k YBP ^{11, 15-19,} embora cada estudo utilizou uma differemetodologia nt para recolher e descontaminar as permafrost ou gelo núcleos. Em alguns casos, os núcleos de perfuração foram esterilizados ^{16, 20-21,} embora a metodologia específica não esclarecer se os ácidos nucleicos estranhos, foram igualmente eliminadas a partir das amostras. Em outros estudos, ¹⁵ isolados bacterianos (por exemplo, Serratia marcescens), bem como as microesferas fluorescentes ²² foram utilizadas para medir a eficácia de processos de descontaminação.

Este experimento foi parte de um estudo maior investigando comunidades microbianas a partir de amostras de permafrost que datam YBP cerca de 40k. O objectivo específico desta parte do estudo foi para descontaminar com sucesso de gelo e permafrost núcleos. Para nosso conhecimento, nenhuma metodologia tem integrado o uso de soluções concebidas para eliminar os ácidos nucleicos estranhos e nucleases associados a partir da porção exterior dos núcleos congelados. Isto apesar do fato de que estas soluções são commonly usado para descontaminar equipamentos de laboratório para experimentos moleculares.

Uma vez que os núcleos foram descontaminadas, o DNA genómico foi extraído utilizando os protocolos desenvolvidos por Griffiths et al. ²³ e TOWE et al. ^24, quantificado utilizando um espectrofotómetro, e diluiu-se com água estéril, isenta de ADN para atingir 20 ng por reacção. Bacterianas genes 16S rRNA foram amplificadas com primers 331F e 797R e sonda BacTaq ²⁵ e 16S archaeal genes rRNA foram amplificadas com primers Arch 349F e Arch 806R e a sonda TM Arch 516F ²⁶ sob as seguintes condições: 95 ° C durante 600 segundos seguido por 45 ciclos de 95 ° C durante 30 seg, 57 ° C durante 60 segundos, e 72 ° C durante 25 seg, com extensão final a 40 ° C durante 30 seg. Todas as reacções foram conduzidas qPCR em duplicado. Os volumes de reacção de 20 ul incluídos 20 ng de ADN, 10 pM de iniciadores, 5 uM de sonda, e 10 ul da mistura de reacção qPCR. normas for qPCR bacteriana e archaea foram preparadas usando ADN genómico de Pseudomonas fluorescens e Halobacterium salinarum, respectivamente. Ambos foram cresceu até à fase log. As contagens foram realizadas e o ADN foi isolado a partir das culturas. O ADN genómico foi quantificada com um espectrofotómetro com o pressuposto de um e seis cópias do gene 16S rRNA por genoma de H. salinarum e P. fluorescens, respectivamente ^27-28. número de cópias dos genes de bactérias e archaea foram calculados com base na curva padrão, log-transformada em conta as especificidades desiguais entre tratamentos, e avaliados por análise de variância.

Composição da comunidade foi determinada por sequenciamento do gene 16S rRNA usando células de fluxo e tecnologias de amplificação ponte e analisar as comunidades com insights quantitativos em ecologia microbiana "(QIIME) ^29. Para a frente e reverso lê foram unidas e depois sequências foram filtrados, indexado,e representantes de alta qualidade foram selecionados para unidades taxonômicas operacionais (OTU) cessão de novo através de um alinhamento de sequência com uma base de dados de referência. sequências alinhadas foram comparados com um banco de dados de referência separado para atribuição taxonômica. Uma tabela OTU nível filo foi criado para determinar a composição da comunidade em geral.

Protocol

1. Preparação Equipamentos e Permafrost Coleção Núcleo Preparação de equipamento e coleta de amostra de campo e equipamentos de preservação Montar trado para coleta de amostras, inserindo o adaptador de unidade no topo do barril e girando a alavanca para travá-lo no lugar. Pin o tubo de adaptador para o adaptador de unidade e fixe o motor no tubo adaptador. Insira os cortadores no barril. Usar ternos de luz dever, luvas de borracha nitrílica e máscaras para reduzir qualquer cont…

Representative Results

O método apresentado poderia ser utilizado para descontaminar amostras congeladas recolhidas de vários ambientes cryosphere, a partir de gelo glacial para permafrost. Aqui, apresentamos os dados especificamente recolhidos a partir de amostras de gelo e permafrost coletados a partir da Pesquisa de Engenharia e Centro de Desenvolvimento – Cold Regiões Laboratório de Pesquisa e Engenharia (ERDC-CRREL) Permafrost túnel localizado na Fox, AK (Figura 1A e 1B).</st…

Discussion

A criosfera oferece acesso a organismos preservados que persistiram sob condições ambientais do passado. Embora a taxa recuperado pode não representar a comunidade histórica completa, aqueles recuperados a partir de análise de amostras de gelo e permafrost glacial pode render valiosas informações históricas sobre seleccionar períodos de tempo ^15-16. Por exemplo, a informação biológica significativa foi elaborado a partir de estudos de gelo que investigam atividade anaeróbica no gelo da Groenlând…

Materials

Auger	Snow, Ice, and Permafrost Research Establishment (SIPRE), Fairbanks, AK	N/A
70% Isopropanol	Walmart	551116880
95% Ethyl Alcohol (denatured)	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	A407-4
DNA decontamination solution, DNA Away	Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA	7010
RNase decontamination solution, RNase Away	Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA	7002
Light Duty Suits	Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA	10606
Nitrile Gloves	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	FFS-700
Antiviral Masks	Curad, Walgreens	CUR3845
Sterile Sample Bags	Nasco, Fort Atkinson, WI	B01445
Steel Microtome Blade	B-Sharp Microknife, Wake Forest, NC	N/A
Metal Rack	Fabricated at CRREL, Hanover, NH	N/A
Tray	Handy Paint Products, Chanhassen, MN	7500-CC
Aluminum Foil	Western Plastics, Temecula, CA	N/A
500 ml Bottle with 0.22 μm Filter	Corning, Corning, NY	430513
Serratia marcescens	ATCC, Manassas, VA	17991
Biosafety Hood	NuAire, Plymouth, MN	NU-425-400
Petri Dish	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	FB0875712
ATCC Agar 181- Tryptone	Acros Organics, NJ	61184-5000
ATCC Agar 181- Glucose	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	BP381-500
ATCC Agar 181- Yeast Extract	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	BP1422-500
ATCC Agar 181- Dipotassium Phosphate	JT Baker, Phillipsburg, NJ	3252-01
ATCC Agar 181- Agar	Difco, Sparks, MD	214530
NanoDrop 2000 UV Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE
Lightcycler 480 System	Roche Molecular Systems, Inc., Indianapolis, IN
Halobacterium salinarum	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA
Pseudomonas fluorescens	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA
Microbial DNA Isolation Kit	MoBio Laboratories, Carlsbad, CA	12224-50
Ear Protection	Elvex	EP-201
Hard Hat	N/A	N/A
Kimwipes	Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA	34705
Glass Wool	Pyrex	430330
Ruler	N/A	N/A
Weighing Tin	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	08-732-100
Sodium chloride	Sigma Aldrich, St Louis, MO	S-9625
Potassium chloride	JT Baker, Phillipsburg, NJ	3040-04
Potassium phosphate, monobasic	JT Baker, Phillipsburg, NJ	3246-01
Potassium phosphate, dibasic	JT Baker, Phillipsburg, NJ	3252-01
Sodium phosphate dibasic, anhydrous	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	BP332-500
50 ml Centrifuge Tubes	Corning, Corning, NY	4558
2 ml Microcentrifuge Tubes	MoBio Laboratories, Carlsbad, CA	1200-250-T
2 ml Ceramic Bead Tubes (1.4 mm)	MoBio Laboratories, Carlsbad, CA	13113-50
Scoopula	Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE	1437520
Balance	Ohaus, Parsippany, NJ	E12130
Diethylpyrocarbonate (DEPC)	Sigma Aldrich, St Louis, MO	D5758
Hexadecyltrimethylammoniabromide (CTAB)	Acros Organics, NJ	22716-5000
Polyethylene glycol 8000	Sigma Aldrich, St Louis, MO	P5413-1KG
Phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1) (pH 8)	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	BP1752-400
Centrifuge	Eppendorf, Hauppauge, NY	5417R
Chloroform-isoamyl alcohol (24:1)	Sigma Aldrich, St Louis, MO	C0549-1PT
TE Buffer	Ambion (Thermo Fisher), Wilmington, DE	AM9860
Pipets	Rainin, Woburn, MA	Pipet Lite XLS, 2, 10, 200, 1nd 1000ul pipets
Pipet tips	Rainin, Woburn, MA	Rainin LTS presterilized, low retention, filtered tips, 10, 20, 200, 1000ul
Vortexor	Scientific Industries, Bohemia, NY	G-560
Vortex Adaptor	MoBio Laboratories, Carlsbad, CA	13000-V1
Clear Bottle	Corning, Corning, NY	C1395500
Amber Bottle	Corning, Corning, NY	C5135250
Bottle Top Filters, 0.22um	Corning, Corning, NY	430513
60 mL Syringe	Becton, Dickenson and Company, Franklin Lakes, NJ	BD 309653
Millex Syringe filters, 0.22 μm	EMD Millipore, Billerica, MA	SLGV033RB
70% Ethanol	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	BP2818-500	diluted & filter sterilized
Isotemp 100 L Oven	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	151030511
Cell Spreader	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	08-100-10
Disposable Inoculating Loops	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	22-363-602