Удаление экзогенных материалов из внешней части замороженных ядер по расследованию Древние биологических сообществ таил Внутри
Summary
Криосфера предлагает доступ к сохранившимся организмов, которые сохранялись при прошлых условиях окружающей среды. Протокол представлен для сбора и обеззаразить вечной мерзлоты ядер почв и льда. Отсутствие экзогенного колоний и ДНК предполагают, что микроорганизмы, обнаруженные представляют Интернете, а не загрязнение от сверления или обработки.
Abstract
The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect conditions over vast time periods and investigation of biological materials harbored inside could provide insight of ancient environments. To appropriately analyze these ecosystems and extract meaningful biological information from frozen soils and ice, proper collection and processing of the frozen samples is necessary. This is especially critical for microbial and DNA analyses since the communities present may be so uniquely different from modern ones. Here, a protocol is presented to successfully collect and decontaminate frozen cores. Both the absence of the colonies used to dope the outer surface and exogenous DNA suggest that we successfully decontaminated the frozen cores and that the microorganisms detected were from the material, rather than contamination from drilling or processing the cores.
Introduction
Криосферы (например, вечномерзлых грунтов, особенности льда, ледниковые снег, фирна и льда) предлагает заглянуть в какие типы организмов сохранялась при прошлых условиях окружающей среды. Так как эти подложки могут быть от десятков до сотен тысяч лет, их микробных сообществ, при сохранившейся заморожены с осаждения, отражают древние условия окружающей среды. Для того, чтобы надлежащим образом проанализировать эти экосистемы и извлечь полезную биологическую информацию из замороженного состояния почв и льда, правильного сбора и обработки замороженных образцов необходимо. Это имеет огромное значение , так как климатические прогнозы для 21 – го века указывают на потенциал выраженного потепления в Арктике и субарктических регионах 1. В частности, интерьер Аляски и Гренландии , как ожидается , чтобы нагреть приблизительно 5 ° C и 7 ° C, соответственно к 2100 году 2,3. Ожидается, что значительное влияние на почву и водные микробные сообщества, и, следовательно, связанной сбиогеохимические процессы. Более теплые температуры и измененное режим осадков , как ожидается , инициировать деградацию вечной мерзлоты во многих областях 2-5 потенциально может привести к более толстой, сезонноталого (активный) слой 6,7, оттаивание мерзлых грунтов, а таяние массивных ледяных тел , таких как льды, ледяные клинья, и сегрегации льда 8. Это позволит резко изменить биогеохимические атрибуты в дополнение к биоразнообразию растений и животных в этих экосистемах.
Ледниковых и сингенетические мерзлота осадка и льда особенности заманили в ловушку химических и биологических доказательств окружающей среды, представляющей то, что жил там в то время формировались особенности. Например, в интерьере Аляске, как Illinoisan и Висконсин в возрасте вечной мерзлоты присутствуют и это вечной мерзлоты, в частности, предоставляет уникальные места начиная от современных до 150000 лет до настоящего времени (YBP), которые содержат биологические и геохимические доказательства ИТПМкт прошлых климатических изменений на биоразнообразие. В результате, эти отложения обеспечивают запись биогеохимии и биоразнообразия в течение многих тысяч лет. Так как область имеет низкие цены отстаивание и никогда не таянии, нетронутые образцы доступны для сбора и анализа, либо сверлить вертикально в почвенном профиле или бурение горизонтально в туннелях. Что еще более важно, обширные записи существуют , которые особенно подчеркивают уникальные биогеохимические особенности вечной мерзлоты в этом регионе 9-14. В частности, применение ДНК-анализа для оценки наличия и степени биоразнообразия в обоих дошедших до наших дней и древних льдов и вечной мерзлоты образцов позволяет исследование взаимосвязи древних условий окружающей среды и среды обитания для оккупации конкретных организмов.
Предыдущие исследования выявили климатические воздействия на млекопитающих, растений и микроорганизмов из образцов , относящихся к 50k YBP 11, 15-19 лет, хотя каждое исследование использовали differeМетодология нт для сбора и обеззараживать вечной мерзлоты или ледяных кернов. В некоторых случаях, сердечники бурения стерилизовали 16, 20-21, хотя конкретная методология не уточнить , были ли чужеродной нуклеиновой кислоты также исключены из образцов. В других исследованиях, бактериальные изоляты 15 (например, Serratia marcescens), а также флуоресцентные микросферы 22 были использованы для измерения эффективности процедур дезактивации.
Этот эксперимент был частью более крупного исследования следственным микробных сообществ из образцов вечной мерзлоты, начиная с приблизительно 40k YBP. Конкретная цель этой части исследования состояла в том, чтобы успешно обеззараживать льда и вечной мерзлоты ядер. Насколько нам известно, ни одна методика не интегрировал использование растворов, предназначенных для устранения иностранных нуклеиновых кислот и связанных с ними нуклеазы из внешней части замороженных ядер. И это несмотря на то, что эти решения являются commonlу используется для обеззараживания лабораторного оборудования для молекулярных экспериментов.
После того, как сердечники были дезактивированы, геномную ДНК экстрагировали с использованием протоколов , разработанных Гриффитс и др. , 23 и Towe и др. 24, количественно с помощью спектрофотометра, и разбавляют стерильной, ДНК , свободной от воды , чтобы достичь 20 нг в реакции. Бактериальные гены 16S рРНК амплифицировали с праймерами 331F и 797R и зонд BacTaq 25 и архей генов 16S рРНК амплифицировали с использованием праймеров Arch 349F и Arch 806R и зонд ТМ Arch 516F 26 при следующих условиях: 95 ° С в течение 600 с последующим 45 циклов 95 ° C в течение 30 сек, 57 ° с в течение 60 сек и при 72 ° C в течение 25 сек с конечным удлинением при 40 ° с в течение 30 сек. Все реакции КПЦР проводились в двух экземплярах. В 20 мкл объемы реакции включали 20 нг ДНК, 10 мкМ праймеров, 5 мкМ зонда и 10 мкл реакционной смеси КПЦР. Стандарты FOг бактериальных и архейного КПЦР были приготовлены с использованием геномной ДНК из Pseudomonas Шогезсепз и Halobacterium Салинарум соответственно. Оба были выращены до логарифмической фазы. отсчеты Пластинчатые были проведены и ДНК выделяли из культур. Геномную ДНК количественно с помощью спектрофотометра с предположением одного и шести копий гена 16S рРНК на геном для Н. Салинарум и P. Шогезсепз соответственно 27-28. были вычислены числа копий бактериальных и архей генов на основе стандартной кривой, логарифмирована для учета неравных отклонений между курсами лечения, и оценены ANOVA.
Состав сообществ определяли путем секвенирования гена 16S рРНК с использованием клеток потока и технологии усиления моста и анализа сообществ с "количественным проникновения в микробной экологии» (QIIME) 29. Вперед и обратного чтения были соединены вместе, а затем последовательности были отфильтрованы, индексированные,а также представители высокого качества были отобраны для De Novo операционные таксономические единицы (ОТУ) назначение через выравнивания последовательностей с эталонной базой данных. Выровненных последовательностей сравнивали с отдельной справочной базы данных для таксономического назначения. Таблица ОТУ уровень филюм был создан для определения общего состава сообщества.
Protocol
Representative Results
Discussion
Криосфера предлагает доступ к сохранившимся организмов, которые сохранялись при прошлых условиях окружающей среды. Хотя восстановленный таксонов не может представлять собой полное историческое сообщество, те извлекают из анализа ледниковых льдов и вечной мерзлоты образцов может да…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded through the U.S. Army Engineer Research and Development Center, Basic Research Program Office. Permission for publishing this information has been granted by the Chief of Engineers.
Materials
| Auger | Snow, Ice, and Permafrost Research Establishment (SIPRE), Fairbanks, AK | N/A | |
| 70% Isopropanol | Walmart | 551116880 | |
| 95% Ethyl Alcohol (denatured) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | A407-4 | |
| DNA decontamination solution, DNA Away | Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA | 7010 | |
| RNase decontamination solution, RNase Away | Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA | 7002 | |
| Light Duty Suits | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 10606 | |
| Nitrile Gloves | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | FFS-700 | |
| Antiviral Masks | Curad, Walgreens | CUR3845 | |
| Sterile Sample Bags | Nasco, Fort Atkinson, WI | B01445 | |
| Steel Microtome Blade | B-Sharp Microknife, Wake Forest, NC | N/A | |
| Metal Rack | Fabricated at CRREL, Hanover, NH | N/A | |
| Tray | Handy Paint Products, Chanhassen, MN | 7500-CC | |
| Aluminum Foil | Western Plastics, Temecula, CA | N/A | |
| 500 ml Bottle with 0.22 μm Filter | Corning, Corning, NY | 430513 | |
| Serratia marcescens | ATCC, Manassas, VA | 17991 | |
| Biosafety Hood | NuAire, Plymouth, MN | NU-425-400 | |
| Petri Dish | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | FB0875712 | |
| ATCC Agar 181- Tryptone | Acros Organics, NJ | 61184-5000 | |
| ATCC Agar 181- Glucose | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP381-500 | |
| ATCC Agar 181- Yeast Extract | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP1422-500 | |
| ATCC Agar 181- Dipotassium Phosphate | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3252-01 | |
| ATCC Agar 181- Agar | Difco, Sparks, MD | 214530 | |
| NanoDrop 2000 UV Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE | ||
| Lightcycler 480 System | Roche Molecular Systems, Inc., Indianapolis, IN | ||
| Halobacterium salinarum | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ||
| Pseudomonas fluorescens | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ||
| Microbial DNA Isolation Kit | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 12224-50 | |
| Ear Protection | Elvex | EP-201 | |
| Hard Hat | N/A | N/A | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 34705 | |
| Glass Wool | Pyrex | 430330 | |
| Ruler | N/A | N/A | |
| Weighing Tin | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 08-732-100 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich, St Louis, MO | S-9625 | |
| Potassium chloride | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3040-04 | |
| Potassium phosphate, monobasic | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3246-01 | |
| Potassium phosphate, dibasic | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3252-01 | |
| Sodium phosphate dibasic, anhydrous | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP332-500 | |
| 50 ml Centrifuge Tubes | Corning, Corning, NY | 4558 | |
| 2 ml Microcentrifuge Tubes | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 1200-250-T | |
| 2 ml Ceramic Bead Tubes (1.4 mm) | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 13113-50 | |
| Scoopula | Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE | 1437520 | |
| Balance | Ohaus, Parsippany, NJ | E12130 | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich, St Louis, MO | D5758 | |
| Hexadecyltrimethylammoniabromide (CTAB) | Acros Organics, NJ | 22716-5000 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Sigma Aldrich, St Louis, MO | P5413-1KG | |
| Phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1) (pH 8) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP1752-400 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | 5417R | |
| Chloroform-isoamyl alcohol (24:1) | Sigma Aldrich, St Louis, MO | C0549-1PT | |
| TE Buffer | Ambion (Thermo Fisher), Wilmington, DE | AM9860 | |
| Pipets | Rainin, Woburn, MA | Pipet Lite XLS, 2, 10, 200, 1nd 1000ul pipets | |
| Pipet tips | Rainin, Woburn, MA | Rainin LTS presterilized, low retention, filtered tips, 10, 20, 200, 1000ul | |
| Vortexor | Scientific Industries, Bohemia, NY | G-560 | |
| Vortex Adaptor | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 13000-V1 | |
| Clear Bottle | Corning, Corning, NY | C1395500 | |
| Amber Bottle | Corning, Corning, NY | C5135250 | |
| Bottle Top Filters, 0.22um | Corning, Corning, NY | 430513 | |
| 60 mL Syringe | Becton, Dickenson and Company, Franklin Lakes, NJ | BD 309653 | |
| Millex Syringe filters, 0.22 μm | EMD Millipore, Billerica, MA | SLGV033RB | |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP2818-500 | diluted & filter sterilized |
| Isotemp 100 L Oven | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 151030511 | |
| Cell Spreader | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 08-100-10 | |
| Disposable Inoculating Loops | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 22-363-602 |
References
- Solomon, S., et al. . Climate Change 2007: The Physical Science Basis. , (2007).
- Marchenko, S., Romanovsky, V., Tipenko, G. Numerical Modeling of Spatial Permafrost Dynamics in Alaska. Proc. Ninth Int. Conferen. Permafr. 29, 1125-1130 (2008).
- Pachauri, R. K., Meyer, L. A. . Climate Change 2014: Synthesis Report. Contributions of Working Groups I, II, and III to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. , (2007).
- Osterkamp, T. E., Romanovsky, V. E. Evidence for warming and thawing of discontinuous permafrost in Alaska. Permafr. Periglac. Process. 10 (1), 17-37 (1999).
- Wolken, J. M., et al. Evidence and implications of recent and projected climate change in Alaska’s forest ecosystems. Ecosphere. 2 (11), 1-35 (2011).
- Hinzman, L. D., Kane, D. L., Gieck, R. E., Everett, K. R. Hydrologic and thermal properties of the active layer in the Alaskan Arctic. Cold Reg. Sci. Technol. 19 (2), 95-110 (1991).
- Hinzman, L. D., Goering, D. J., Kane, D. L. A distributed thermal model for calculating temperature profiles and depth of thaw in permafrost regions. J. Geophys. Res.: Atmos. 103 (D22), 28975-28991 (1998).
- Osterkamp, T. E., Jorgenson, J. C. Warming of Permafrost in the Arctic National Wildlife Refuge. Alaska. Permafr. Periglac. Process. 17, 65-69 (2006).
- Petrone, K. C., Jones, J. B., Hinzman, L. D., Boone, R. D. Seasonal export of carbon, nitrogen, and major solutes from Alaskan catchments with discontinuous permafrost. J. Geophys. Res. 111, G02020 (2006).
- Guo, L., Ping, C. -. L., Macdonald, R. W. Mobilization pathways of organic carbon from permafrost to arctic rivers in a changing climate. Geophys. Res. Lett. 34 (13), L13603 (2007).
- Katayama, T., et al. Phylogenetic analysis of bacteria preserved in a permafrost ice wedge for 25,000 years. Appl. Environ. Microbiol. 73 (7), 2360-2363 (2007).
- Katayama, T., et al. Glaciibacter superstes gen. nov., sp. nov., a novel member of the family Microbacteriaceae isolated from a permafrost ice wedge. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 59, 482-486 (2009).
- Waldrop, M. P., White, R., Douglas, T. A. Isolation and identification of cold-adapted fungi in the Fox Permafrost Tunnel, Alaska. Proc. Ninth Int. Conferen. Permafr. , 1887-1891 (2008).
- Douglas, T. A., et al. Biogeochemical and geocryological characteristics of wedge and thermokarst-cave ice in the CRREL Permafrost Tunnel. Alaska Permafr. Periglac. Process. 21 (2), 120-128 (2011).
- Willerslev, E., et al. Diverse plant and animal genetic records from Holocene and Pleistocene sediments. Science. 300 (5620), 791-795 (2003).
- Bellemain, E., et al. Fungal palaeodiversity revealed using high-throughput metabarcoding of ancient DNA from Arctic permafrost. Environ. Microbiol. 15 (4), 1176-1189 (2013).
- Steven, B., Pollard, W. H., Greer, C. W., Whyte, L. G. Microbial diversity and activity through a permafrost/ground ice core profile from the Canadian high Arctic. Environ. Microbiol. 10 (12), 3388-3403 (2008).
- Lorenzen, E. D., et al. Species-specific responses of Late Quaternary megafauna to climate and humans. Nature. 479 (7373), 359-364 (2011).
- Wilhelm, R. C., Radtke, K., Mykytczuk, N. C. S., Greer, C. W., Whyte, L. G. Life at the wedge: The activity and diversity of Arctic ice wedge microbial communities. Astrobiol. 12 (4), 347-360 (2012).
- Sheriden, P. P., Miteva, V. I., Brenchley, J. E. Phylogenetic analysis of anaerobic psychrophilic enrichment cultures obtained from a Greenland glacier ice core. Appl. Environ. Microbiol. 69 (4), 2153-2160 (2003).
- Rivkina, E., et al. Biogeochemistry of methane and methanogenic archaea in permafrost. FEMS Microbiol. Ecol. 61 (1), 1-15 (2007).
- Juck, D. F., et al. Utilization of fluorescent microspheres and a green fluorescent protein-marked strain for assessment of microbiological contamination of permafrost and ground ice core samples from the Canadian High Arctic. Appl. Environ. Microbiol. 71 (2), 1035-1041 (2005).
- Griffiths, R. I., Whiteley, A. S., O’Donnell, A. G., Bailey, M. J. Rapid method for coextraction of DNA and RNA from natural environments for analysis of ribosomal DNA- and rRNA-based microbial community composition. Appl. Environ. Microbiol. 66 (12), 5488-5491 (2000).
- Töwe, S., et al. Improved protocol for the simultaneous extraction and column-based separation of DNA and RNA from different soils. J. Microbiol. Methods. 84 (3), 406-412 (2011).
- Nadkarni, M. A., Martin, F. E., Jacques, N. A., Hunter, N. Determination of bacterial load by real-time PCR using a broad range (universal) probe and primers set. Microbiol. 148, 257-266 (2002).
- Takai, K., Horikoshi, K. Rapid detection and quantification of members of the archaeal community by quantitative PCR using fluorogenic probes. Appl. Environ. Microbiol. 66 (11), 5066-5072 (2000).
- Fogel, G. B., Collins, C. R., Brunk, C. F. Prokaryotic genome size and SSU rDNA copy number: Estimation of microbial relative abundance from a mixed population. Microb. Ecol. 38, 93-113 (1999).
- Bodilis, J., Nsigue-Meilo, S., Besaury, L., Quillet, L. Variable copy number, intra-genomic heterogeneities and later transfers of the 16S rRNA gene in Pseudomonas. PLOS One. 7, e35647 (2012).
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
- Sellmann, P. V. . Geology of the USA CRREL permafrost tunnel, Fairbanks, Alaska. US Army Cold Reg. Res. Eng. Lab. Technical Rep. 199. , (1967).
- Sellmann, P. V. . Additional information on the geology and properties of materials exposed in the USA CRREL permafrost tunnel. US Army CRREL Special Rep. , (1972).
- Christner, B. C., Mikucki, J. A., Foreman, C. M., Denson, J., Priscu, J. C. Glacial ice cores: A model system for developing extraterrestrial decontamination protocols. Icarus. 174 (2), 572-584 (2005).
- Mackelprang, R., et al. Metagenomic analysis of a permafrost microbial community reveals a rapid response to thaw. Nature. 480 (7377), 368-371 (2011).
- Champlot, S., et al. An efficient multistrategy DNA decontamination of PCR reagents for hyper sensitive PCR applications. PLoS One. 5 (9), e13042 (2010).
- Yergeau, E., Hogues, H., Whyte, L. G., Greer, C. W. The functional potential of high Arctic permafrost revealed by metagenomic sequencing, qPCR, and microarray analyses. The ISME J. 4 (9), 1206-1214 (2010).
- Welzl, G., Schloter, M. Bacterial community structure in soils of the Tibetan Plateau affected by discontinuous permafrost or seasonal freezing. Biol. Fertil. Soils. 50 (3), 555-559 (2014).
- Vishnivetskaya, T. A., et al. Commercial DNA extraction kits impact observed microbial community composition in permafrost samples. FEMS Microbiol. Ecol. 87 (1), 217-230 (2014).
- Wagner, D., Kobabe, S., Liebner, S. Bacterial community structure and carbon turnover in permafrost-affected soils of the Lena Delta, northeastern Siberia. Can. J. Microbiol. 55 (1), 73-83 (2009).
- Jiang, N., et al. Characteristic microbial communities in the continuous permafrost beside the bitumen in Qinghai-Tibetan Plateau. Environ. Earth Sci. 74, 1343-1352 (2015).
