Axon guidance molecules regulate neuronal migration and targeted growth-cone navigation. We present a powerful method, the stripe assay, to assess the ability of guidance molecules to attract or repulse neurons. In this protocol, we demonstrate the stripe assay by showing FLRT2’s ability to repel cultured hippocampal neurons.
Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to navigate axonal growth. Netrin, slit, semaphorin, and ephrins are known guidance molecules that can attract or repel axons upon binding to receptors and co-receptors on the axon. The activated receptors initiate various signaling molecules in the growth cone that alter the structure and movement of the neuron. Here, we describe the detailed protocol for a stripe assay to assess the ability of a guidance molecule to attract or repel neurons. In this method, dissociated hippocampal neurons from E15.5 mice are cultured on laminin-coated dishes processed with alternating stripes of ectodomain of fibronectin and leucine-rich transmembrane protein-2 (FLRT2) and control immunoglobulin G (IgG) fragment crystallizable region (Fc) protein. Both axons and cell bodies were strongly repelled from the FLRT2-coated stripe regions after 24 h of culture. Immunostaining with tau1 showed that ~90% of the neurons were distributed on the Fc-coated stripes compared to the FLRT2-Fc-coated stripes (~10%). This result indicates that FLRT2 has a strong repulsive effect on these neurons. This powerful method is applicable not only for primary cultured neurons but also for a variety of other cells, such as neuroblasts.
अक्षतंतु मार्गदर्शन प्रक्रिया है जिसके द्वारा नवगठित न्यूरॉन्स तंत्रिका तंत्र 1,2 के विकास के दौरान अपने लक्ष्य को एक्सोन भेज रहा है। विकासशील एक्सोन उनकी नोक विकास शंकु नामक स्थान पर एक अत्यधिक गतिशील संरचना ले। विकास शंकु अक्षतंतु के पथ नेविगेट करने के लिए बाह्य संकेतों होश। ऐसे भट्ठा, semaphorin के रूप में मार्गदर्शन अणुओं, और ephrins, आकर्षित करने या उपयुक्त रिसेप्टर्स और अक्षतंतु 1,3,4 पर सह रिसेप्टर्स के साथ उनकी बातचीत के आधार पर एक्सोन पीछे हटाना कर सकते हैं। सक्रिय रिसेप्टर्स विकास शंकु कि अक्षतंतु और विकास-कोन आंदोलनों के लिए अपने cytoskeletal संगठन को प्रभावित करने के लिए संकेत हस्तांतरण।
विभिन्न तरीकों attractant और से बचाने वाली क्रीम के अणुओं की कार्रवाई का मूल्यांकन करने के लिए विकसित किया गया है। केमो-attractants और repellents एक ढाल एकाग्रता के साथ विकास / संस्कृति माध्यम में प्रशासित किया जा सकता है (उदाहरण के लिए।, डन कक्ष या μ-स्लाइड) माइक्रो-P से 5,6, एक अत्यधिक ध्यान केंद्रित स्थान मेंipette (जैसे।, मोड़ परख) 7 या स्नान आवेदन (जैसे।, विकास शंकु पतन परख) 8,9 द्वारा एक समरूप एकाग्रता में।
अन्य तरीकों एक धारी परख या microcontact मुद्रण (μCP), जिसमें एक केमो-attractant या बचाने वाली क्रीम एक सब्सट्रेट 10-12 के रूप में एक थाली की सतह पर लेपित है शामिल हैं। Thestripe परख मूल रूप से लड़की retino-tectal प्रणाली 13 में स्थलाकृतिक मानचित्रण का विश्लेषण करने के लिए 1987 में Bonhoeffer और उनके सहयोगियों द्वारा विकसित किया गया था। मूल विधि पॉली कार्बोनेट nucleopore धारीदार और meshed matrices का उपयोग कर झिल्ली पर कोट प्रोटीन के लिए एक निर्वात प्रणाली की आवश्यकता है। बाद के संस्करणों में, पुनः संयोजक प्रोटीन सीधे एक संस्कृति की थाली की सतह पर एक धारीदार पैटर्न में संकीर्ण भट्ठा सिलिकॉन matrices 14,15 का उपयोग कर मुद्रित किया गया। हाल ही में, विभिन्न अनुसंधान समूहों सफलतापूर्वक अक्षतंतु मार्गदर्शन अणु गतिविधियों 16-21 का विश्लेषण करने के लिए इस पट्टी परख आवेदन किया है।
<p claएस एस = "jove_content"> यहाँ, हम विस्तृत प्रोटोकॉल एक पट्टी परख है कि आकर्षण या अलग hippocampal न्यूरॉन्स के लिए अक्षतंतु मार्गदर्शन अणुओं के प्रतिकर्षण के उपाय के लिए उपस्थित थे। विशेष रूप से, इस विधि न्यूनतम सुसज्जित प्रयोगशाला सेटिंग में लागू किया जा सकता है। इस परख के लिए, एक fluorescently लेबल सब्सट्रेट और एक नियंत्रण प्रोटीन की बारी धारियों 90 माइक्रोन slits के साथ एक सिलिकॉन मैट्रिक्स का उपयोग कर एक प्लास्टिक पकवान पर उत्पन्न और laminin साथ लेपित हैं। हमारे प्रदर्शन में, अलग E15.5 चूहों से hippocampal न्यूरॉन्स फ़ाइब्रोनेक्टिन और leucine अमीर transmembrane प्रोटीन 2 (FLRT2) और एफसी प्रोटीन 21 पर नियंत्रण की पुनः संयोजक ectodomain की धारियों बारी पर सुसंस्कृत थे। संस्कृति के 24 घंटे के बाद, दोनों एक्सोन और न्यूरॉन्स सेल निकायों जोरदार FLRT2 धारियों से पीछे धकेल दिया गया। एक विरोधी Tau1 एंटीबॉडी के साथ धुंधला से पता चला है कि ~ न्यूरॉन्स की 90% FLRT2-एफसी पर ~ 10% की तुलना में एफसी लेपित क्षेत्रों पर वितरित किए गए, यह दर्शाता है कि FLRT2 एक मजबूत प्रतिकारक हैhippocampal न्यूरॉन्स 21 के लिए कार्य करते हैं।इस प्रोटोकॉल एक पट्टी परख E15.5 माउस हिप्पोकैम्पस से पुनः संयोजक प्रोटीन और अलग न्यूरॉन्स का उपयोग करता है वर्णन करता है। इस परख ब्याज की एक पुनः संयोजक प्रोटीन एक धारीदार पैटर्न में रखा न्यूरॉन्स की, प्?…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by Grants-in-Aid for Scientific Research from the Japan Society for the Promotion of Science (23700412, 25122707 and 26670090 to S.Y.).
15 mL centrifuge tube | Violamo | 1-3500-01 | |
4% Paraformaldehyde (PFA) | Nacalai | 01954-85 | |
Alexa Fluor 488 Goat anti-human IgG antibody | Thermo Scientific | A11013 | |
Alexa Fluor 594 Donkey anti-mouse IgG antibody | Thermo Scientific | A-21203 | Dilution 1/500 |
Anti-Tau1 antibody | Chemicon | MAB3420 | Dilution 1/200 |
Antifade | Thermo Scientific | P7481 | Alternative mounting media may be used |
B27 supplement | Thermo Scientific | 17504-044 | Dilution 1/50 |
Bovine serum albumin | Sigma | 01-2030-2 | |
Cell strainer 100 um | BD Falcon | 352360 | |
Centrifugation machine | Kubota | 2410 | |
Cover glass 18mmx18mm | Matsunami | 18×18 mm No. 1 | |
DAKO pen | DAKO | S2002 | Alternative water-repellent pen may be used |
Disposable scalpel | Feather | 2975#11 | |
FBS | Thermo Scientific | 10437-028 | |
Fluorecent microscope | Nikon | E600 | |
Forceps No. 5 | Fine Science Tools | 11254-20 | |
GlutaMAX | Thermo Scientific | 35050-061 | Dilution 1/200 |
Hamilton Syringe | Hamilton | 805N | 22 gauge, 50 uL |
HBSS | Thermo Scientific | 14170-112 | |
Human IgG, Fc Fragment | Jackson | 009-000-008 | |
Laminin | Thermo Scientific | 23017-015 | |
Neurobasal | Thermo Scientific | 21103-049 | |
Normal Donkey Serum | Jackson | 017-000-121 | |
PBS | Nacalai | 14249-24 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15070-063 | Dilution 1/100 |
Plastic culture dish, 60 mm | Thermo Scientific | 150288 | |
Silicone Matrices | Available and purchasable from Prof. Martin Bastmeyer (bastmeyer@kit.edu) | ||
Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
Tip, 1000 uL | Watson | 125-1000S | |
Transparent sticky tape | Tesa | 57315 | Alternative sticky tape may be used |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Trypan blue, 0.4% | Bio-Rad | 145-0013 | |
Trypsin/EDTA | Thermo Scientific | 25300-054 | |
Culture medium | Neurobasal supplemented with B27, GlutaMAX and Penicillin-Streptomycin. |