Stripe Ensaio para estudar a atividade atração ou repulsão de um substrato de proteína utilizando dissociado neurônios do hipocampo

Summary

Axon guidance molecules regulate neuronal migration and targeted growth-cone navigation. We present a powerful method, the stripe assay, to assess the ability of guidance molecules to attract or repulse neurons. In this protocol, we demonstrate the stripe assay by showing FLRT2’s ability to repel cultured hippocampal neurons.

Abstract

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to navigate axonal growth. Netrin, slit, semaphorin, and ephrins are known guidance molecules that can attract or repel axons upon binding to receptors and co-receptors on the axon. The activated receptors initiate various signaling molecules in the growth cone that alter the structure and movement of the neuron. Here, we describe the detailed protocol for a stripe assay to assess the ability of a guidance molecule to attract or repel neurons. In this method, dissociated hippocampal neurons from E15.5 mice are cultured on laminin-coated dishes processed with alternating stripes of ectodomain of fibronectin and leucine-rich transmembrane protein-2 (FLRT2) and control immunoglobulin G (IgG) fragment crystallizable region (Fc) protein. Both axons and cell bodies were strongly repelled from the FLRT2-coated stripe regions after 24 h of culture. Immunostaining with tau1 showed that ~90% of the neurons were distributed on the Fc-coated stripes compared to the FLRT2-Fc-coated stripes (~10%). This result indicates that FLRT2 has a strong repulsive effect on these neurons. This powerful method is applicable not only for primary cultured neurons but also for a variety of other cells, such as neuroblasts.

Introduction

Orientação Axon é o processo pelo qual os neurónios recentemente formadas enviar axónios para o alvo durante o desenvolvimento do sistema nervoso ^1,2. axônios em desenvolvimento realizar uma estrutura altamente móveis em sua ponta chamado cone de crescimento. O cone de crescimento detecta sinais extracelulares para navegar o caminho do axônio. Moléculas de orientação, tais como fenda, semaforina, e Efrinas, pode atrair ou repelir axônios dependendo de sua interação com receptores adequados e co-receptores na axônio ^1,3,4. Os receptores activados transferir sinais para o cone de crescimento que afetam sua organização do citoesqueleto para axônio e crescimento de cone movimentos.

Vários métodos têm sido desenvolvidos para avaliar a acção de moléculas atractivas e repelentes. Quimio-atractores e repelentes pode ser administrado para o meio de crescimento / cultura com uma concentração de gradiente (por ex., Câmara de Dunn ou u-lâminas) ^5,6, em um local altamente concentrada por micro-Pipette (por exemplo., ensaio de torneamento) ⁷ ou a uma concentração homogénea por aplicação de banho (por exemplo., ensaio de colapso do cone de crescimento) ^8,9.

Outros métodos incluem um ensaio de listra ou impressão microcontact (μCP), em que um quimio-atractor ou repelente é revestido sobre a superfície de uma placa como um substrato ^10-12. Thestripe ensaio foi originalmente desenvolvido por Bonhoeffer e seus colegas em 1987 para analisar o mapeamento topográfico do pintainho sistema retino-tectal ^13. O método original necessário um sistema de vácuo para proteínas de revestimento para membranas de policarbonato Nucleopore usando listrado e matrizes em malha. Nas versões mais recentes, as proteínas recombinantes foram directamente impressa sobre a superfície de uma placa de cultura num padrão listrado utilizando matrizes de silício estreita fenda ^14,15. Recentemente, vários grupos de pesquisa têm aplicado com sucesso neste ensaio tarja para a análise das actividades de moléculas de orientação axônio ^16-21.

<p class = "jove_content"> Aqui, apresentamos o protocolo detalhado para um ensaio de tarja que mede a atração ou repulsão de moléculas de orientação axônio para os neurônios do hipocampo dissociados. Notavelmente, este método pode ser aplicado em ambientes laboratoriais minimamente equipados. Para este ensaio, as listras alternadas de um substrato marcado por fluorescência e uma proteína de controlo são gerados em um prato de plástico utilizando uma matriz de silício com fendas 90 mícrons e revestidas com laminina. Em nossa demonstração, dissociada neurônios do hipocampo de camundongos E15.5 foram cultivadas em faixas alternadas de ectodom�io recombinante de fibronectina e proteína-2 transmembrana (FLRT2) rica em leucina e controlar proteína Fc ^21. Após 24 h de cultura, ambos os axónios e corpos celulares dos neurónios foram fortemente repelido das listras FLRT2. A coloração com um anticorpo anti-Tau1 ~ revelou que 90% dos neurónios foram distribuídos nas regiões revestidas com Fc, em comparação com ~ 10% na FLRT2-Fc, indicando que tem uma forte FLRT2 repulsivofunção para os neurônios do hipocampo ^21.

Protocol

Procedimentos envolvendo indivíduos animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional animal em Hamamatsu University School of Medicine. 1. Preparação de Matrizes Ferver 4-8 matrizes de silicone em um forno de microondas ou num prato quente durante 5 minutos e deixar secar completamente durante 1 h sob um fluxo laminar (lado listrado para cima). Nota: Os seguintes procedimentos devem ser realizados sob fluxo laminar. Soprar ar comprimido ou com fita adesiva transp…

Representative Results

Neurônios do hipocampo dissociada de camundongos E15.5 foram semeados e cultivados por 24 h em listras de fluorescente etiquetado controle Fc (Figura 3A-C) ou FLRT2-Fc (Figura 3D-F) alternando com Fc não marcado controle. Em ambos os casos, os neurônios foram agregadas e estendeu seus axônios como pacotes. No controle listras Fc / Fc, os neurônios foram distribuídos uniformemente sobre as listras fluorescente etiquetado e não marcadas, e eles este…

Discussion

Este protocolo descreve um ensaio de faixa que usa proteína recombinante e os neurónios dissociados a partir de hipocampo de rato E15.5. Este ensaio permite a observação de respostas repulsivas eficiente, atraentes, ou neutras de neurónios para uma proteína recombinante de interesse colocado num padrão às riscas. Uma grande vantagem deste protocolo é o método simples para gerar as tiras, em que a proteína está directamente impressos sobre a superfície de um prato de plástico, em comparação com o método …

Materials

15 mL centrifuge tube	Violamo	1-3500-01
4% Paraformaldehyde (PFA)	Nacalai	01954-85
Alexa Fluor 488 Goat anti-human IgG antibody	Thermo Scientific	A11013
Alexa Fluor 594 Donkey anti-mouse IgG antibody	Thermo Scientific	A-21203	Dilution 1/500
Anti-Tau1 antibody	Chemicon	MAB3420	Dilution 1/200
Antifade	Thermo Scientific	P7481	Alternative mounting media may be used
B27 supplement	Thermo Scientific	17504-044	Dilution 1/50
Bovine serum albumin	Sigma	01-2030-2
Cell strainer 100 um	BD Falcon	352360
Centrifugation machine	Kubota	2410
Cover glass 18mmx18mm	Matsunami	18×18 mm No. 1
DAKO pen	DAKO	S2002	Alternative water-repellent pen may be used
Disposable scalpel	Feather	2975#11
FBS	Thermo Scientific	10437-028
Fluorecent microscope	Nikon	E600
Forceps No. 5	Fine Science Tools	11254-20
GlutaMAX	Thermo Scientific	35050-061	Dilution 1/200
Hamilton Syringe	Hamilton	805N	22 gauge, 50 uL
HBSS	Thermo Scientific	14170-112
Human IgG, Fc Fragment	Jackson	009-000-008
Laminin	Thermo Scientific	23017-015
Neurobasal	Thermo Scientific	21103-049
Normal Donkey Serum	Jackson	017-000-121
PBS	Nacalai	14249-24
Penicillin-Streptomycin	Thermo Scientific	15070-063	Dilution 1/100
Plastic culture dish, 60 mm	Thermo Scientific	150288
Silicone Matrices			Available and purchasable from Prof. Martin Bastmeyer (bastmeyer@kit.edu)
Stereo Microscope	Olympus	SZ61
Tip, 1000 uL	Watson	125-1000S
Transparent sticky tape	Tesa	57315	Alternative sticky tape may be used
Triton X-100	Sigma	T8787
Trypan blue, 0.4%	Bio-Rad	145-0013
Trypsin/EDTA	Thermo Scientific	25300-054
Culture medium			Neurobasal supplemented with B27, GlutaMAX and Penicillin-Streptomycin.